Componentele alimentare și influența lor asupra patogeniei diabetului autoimun la om și
1 TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Catedra de fiziologie nutrițională Componentele alimentare și influența lor asupra patogeniei diabetului autoimun la om și șoareci Daniela Bettina Müller Copie completă a tezei de doctorat aprobată de Centrul științific Weihenstephan pentru nutriție, utilizare a terenurilor și mediu de la Universitatea Tehnică din München. Doctor în științe gospodărești și nutriționale Președinte: examinator al disertației: prof. Univ. Dr. J. J. Hauner 1. Prof. univ. Dr. H. Daniel 2a apl. Prof. Dr. A-G. Ziegler Disertația a fost trimisă la Universitatea Tehnică din München la data de și acceptată de Centrul de Știință Weihenstephan pentru Nutriție, Utilizarea Terenului și Mediu pe.
2 Pentru cei doi bunicii mei
3 Cuprins Cuprins 1 Sarcină Introducere și prezentare generală a literaturii Bazele diabetului de tip 1 Semnificația geneticii Patogenia și fondul imunologic al diabetului de tip 1 Grâul și fracțiunile sale proteice Boala celiacă și asocierea dintre diabetul de tip 1 și boala celiacă Influența proteinelor din grâu asupra dezvoltării diabetului autoimun la modelele animale Diabetul de tip 1 Influența factorilor dietetici asupra dezvoltării diabetului autoimun în modelul animal al laptelui de vacă și al fracțiunilor sale proteice Asociere cu diabet zaharat de tip 1 Material și metode Investigații pe modelul mouse-ului NOD Grup de șoareci Diete Protocol Experiență parțială 1 și 1a Protocol Experiență parțială Protocol Experiment parțial I.
4 Cuprins 3.2 Metode experimentale Extracția cerealelor pentru obținerea fracțiilor de proteine Producerea de extracte de proteine din alimente sau furaje Separarea electroforetică a fracțiilor de proteine (SDS-Pagina) Determinarea conținutului de proteine din extracte Măsurători ale autoanticorpilor de insulină IgG în seruri murine și umane Testul de legare a radioligandului cu componentele alimentare cu insulină de pui Măsurători ale autoanticorpilor de insulină IgA în seruri umane Statistici Rezultate Experimente de hrănire cu șoareci NOD Consumul de alimente și dezvoltarea greutății șoarecilor NOD în grupurile experimentale Experiment parțial 1 Furaj conținut de grâu și cazeină comparativ cu o dietă bazală Șoareci NOD la vârsta de zece săptămâni de viață în experiment parțial Incidența diabetului la șoareci NOD înainte și după 25 de săptămâni de viață în experiment parțial experiment parțial 2 Cuantificarea grâului și a componentelor de grâu erarea și calitatea fracțiilor extrase de grâu Riscul de diabet cumulat al șoarecilor NOD în testul parțial Prevalența autoanticorpului insulinic al șoarecilor NOD la vârsta de zece săptămâni în testul parțial II
6 Cuprins 5.1 Experimente de hrănire cu șoareci NOD Efecte ale diferitelor surse de proteine asupra dezvoltării diabetului în modelul NOD Efectele suplimentelor eșalonate de grâu și ale fracțiilor individuale de proteine din grâu asupra dezvoltării diabetului în modelul NOD Influența altor componente alimentare în dieta copiilor mici asupra dezvoltării diabetului în modelul NOD Concluzie finală a experimentelor nutriționale la NOD -Reactivitatea modelului autoanticorpilor de insulină umană cu insulina de pui și măsurarea izotipului IgA Comportamentul de legare a autoanticorpilor insulinei la insulina de pui în serurile umane Identificarea izotipurilor de insulină IgA autoanticorpi în serul uman. Examinarea legării autoanticorpului insulinei la proteinele individuale cu componente nutriționale în serurile umane Fracțiuni de lapte de vacă Analiza finală a testelor pe autoanticorpii de insulină cu reactivitate încrucișată Perspectivele viitoare Sumar și concluzii Literatura IV
7 Cuprins Cuprins. Lista figurilor. Lista de mese. Lista de abrevieri. I-V VI-VIII IX-X XI Publicații anterioare. XII curriculum vitae. XIII-XIV mulțumire. XV V
10 Lista figurilor Fig. 26 Legarea IAA de lapte, proteine din lapte, formule și grâu în comparație cu insulina umană Fig. 27 Curbele de legare ale IAA de componentele alimentare 75 Fig. 28 Curbele de legare ale IAA de proteinele din lapte Fig. 29 Legarea IAA de diferite proteine din lapte în comparație cu Insulină (partea 1) Fig. 30 Legarea IAA la diferite proteine din lapte comparativ cu insulina (partea 2) Fig. 31 Legarea IAA la diferite proteine din lapte în comparație cu insulina (partea 3) VIII
12 Lista tabelelor Tab. 20 Analiza concentrației de proteine a soluțiilor alimentare extrase în diferite diluții și a valorilor medii rezultate Tab. 21 Caracteristicile persoanelor testate ale căror IAA se leagă de extractul de lapte praf X
13 Lista abrevierilor Lista abrevierilor Fig. Figura AK Anticorp asparagină cpm dezintegrare radioactivă pe minut (numărare pe minut) GAD (A) (anticorpi împotriva) glutamatului decarboxilază Complexul de histocompatibilitate HLA (antigenul leucocitului uman) I (A) A Anticorpul anti-insulină (auto) IA-2 ( A) (anticorpi împotriva) proteinei tirozin fosfatazei IA-2 ICA anticorpi cu celule insulare Ig imunoglobulină MHC complexul principal de histocomabilitate min. Proces-verbal n.a. necunoscut NOD diabetic nonobez RBA radioligand test de legare rpm runde pe minut T1D diabet tip 1 Tab. Tabel TBST soluție salină tamponată Tris plus Tween TBT Tris tamponată Tween t-tg țesut-tranglutaminază vs. versus Organizația Mondială a Sănătății OMS ZnT8 Zinc Transporter 8 XI
16 sarcini care ar putea fi considerate potențiale antigene țintă inițiale ale IAA. În general, această lucrare ar trebui să stabilească influența posibilă a componentelor alimentare individuale asupra procesului imun al diabetului autoimun. Utilizând datele obținute in vivo pe modelul NOD, componentele alimentare potențial diabetogene sunt testate pe seruri umane. Folosind aceste modele in vitro, se va investiga în ce măsură evenimentele imune ale diabetului de tip 1 ar putea fi inițial declanșate de reacțiile încrucișate cu componentele alimentare. Rezultatele acestor experimente ar putea descrie alte mecanisme necunoscute anterior ale patogenezei diabetului și, astfel, pot fi utilizate pentru dezvoltarea terapiilor primare pentru a preveni dezvoltarea diabetului de tip 1 în copilăria timpurie. 3
41 Material și metode (Dieta D), un al doilea grup a rămas în dieta A care conține grâu și un al treilea grup a rămas în dieta fără grâu B. Puii de sex feminin din grupul de reproducere al dietei fără gluten și fără cazeină C au fost repartizați la un grup de test format din trei săptămâni de viață 9 femele care au rămas în dieta C (vezi Fig. 4). Perechi de reproducție Dieta fără gluten, care conține cazeină B Dieta fără gluten și cazeină C Grupuri de test Dieta B n = 12 Dieta A n = 12 Dieta D n = 12 Dieta C n = 9 Fig. 4 Alocarea șoarecilor femele NOD la grupele de reproducere și test în testul parțial 1. Tinerii masculi din grupa de reproducere a dietei fără gluten B au fost separați de baraje după lactație la vârsta de trei săptămâni, așa cum este descris pentru animalele femele și împărțiți în trei grupe de testare. Analog cu gruparea șoarecilor femele, unul dintre grupuri a primit dieta de referință (dieta D), un al doilea a primit dieta A care conține grâu, iar un al treilea grup a rămas în dieta B fără grâu (vezi Fig. 4a). Perechi de reproducție Dieta fără gluten, care conține cazeină B Grupuri de testare Dieta B n = 11 Dieta A n = 10 Dieta D n = 12 Fig. 4a Alocarea șoarecilor masculi NOD la grupele de reproducere și de testare din sub-experiment 1a. 28
46 Material și metode Pentru a separa fracțiunile de proteine conținute în grâu una de alta, a fost efectuată o extracție modificată în trei etape, prin care în prima etapă de extracție albuminele și globulinele erau prezente în supernatant, în a doua etapă de extracție prolaminele (gliadinele) erau conținute în supernatant și cu În ultima etapă, gluteninele au fost separate (Wilson și Goulding 1991, Mimouni și colab. 1998, Nicolas și colab. Idris și colab. 2003). Făină Albumine și Globuline Centrifugare de extracție> 2x Sediment Gliadine Centrifugare de extracție> 3x Gluteline Sediment Extraction (atmosferă N2) Centrifugare> 2x Centrifugare a tuturor supernatanților Depozitare precipitații la 18 C Fig. 7 Schema de extracție a proteinelor și separarea fracțiilor de făină de grâu. S-au cântărit 0,1 g de făină de grâu comercială de tip 550, s-a adăugat 1 ml tampon Sörensen (pH 7,35) și amestecul a fost agitat la 4 ° C timp de 20 minute. După centrifugare (20 min, 1000 rpm, Centrifuga Sorvall RC 5B Superspeed) la 4 ° C, supernatantul a fost îndepărtat și sedimentul a fost extras din nou folosind aceeași metodă după adăugarea tamponului Sorensen. Cei doi supernatanti au fost combinați și depozitați la 4 ° C până la finalizarea etapelor ulterioare de extracție. 33
60 de rezultate Obținerea cantității de albumine și globuline care au fost administrate șoarecilor NOD cu apa potabilă. Pentru verificarea metodei de extracție, proteinele principale ale făinii de grâu au fost fracționate și curățenia separării a fost verificată prin electroforeză pe gel (material și metode 3.2.3). Albumine standard și globuline Glutenine Gliadine Fig. 10 Separarea electroforetică a fracțiunilor de proteine din grâu pe un gel de poliacrilamidă 12%. Fracțiile proteice individuale sunt atribuite benzilor respective și greutățile moleculare sunt prezentate în kda pe partea stângă. În plus, eficiența extracției a fost determinată prin determinarea cantitativă a proteinelor cu un kit de testare a proteinelor BCA (a se vedea Tab. 16 și Material și metode 3.2.4) și a fost utilizat ca bază pentru extracții un randament de aproximativ 50% din fracția de albumină și globulină dorită. plasat. 47