Cuantificarea activității chimiotactice monocite in vivo și caracterizarea monocitelor sanguine

rezumat

Aici prezentăm un protocol pentru cuantificarea activității chimiotactice a monocitelor din sânge la modelele de șoarece pentru a evalua efectele intervențiilor nutriționale, farmacologice și genetice asupra monocitelor din sânge și a macrofagelor derivate din denmonțiți la modelele de șoareci cu proteine-1 monocite-chemoattractant (MCP-1) - dopuri de gel ventilate cu membrană de subsol încărcate.

Abstract

Introducere

Protocol

Toate metodele descrise în acest protocol au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Școala de Medicină Wake Forest.

1. Pregătirea soluției derivate din membrană bazală cu factor de creștere, încărcat cu MCP-1

NOTĂ: Aceasta este o procedură sterilă.

2. Injectarea soluției derivate din membrană de subsol

3. Recoltarea dopului de gel derivat din membrana bazală

4. Digerați dopul de gel derivat din membrana bazală

5. Determinarea compoziției celulare în suspensia celulară cu analiza Western blot (scWB) cu o singură celulă

6. Scoateți cipul scWB

Rezultate reprezentative

Pentru a accesa reacția chemolockantă a monocitelor din sânge, am injectat o soluție derivată de membrană derastată încărcată de vehicul și MCP-1 în flancurile stânga și dreaptă ale fiecărui șoarece. Dopurile de gel derivate din membrana bazală au fost îndepărtate, detașate și celulele recrutate în fiecare dop 1, 3 și 5 zile după injecții (Figura 1A). Prin scăderea numărului de celule din conectorul încărcat de vehicul (bare deschise) din numărul de celule din conectorul încărcat MCP-1 (bare închise), am obținut numărul de celule care au fost recrutate în mod specific ca răspuns la MCP-1 (numărul celulei, Figura 1B). Am observat recrutarea specifică MCP-1 accelerată și acumularea de celule în perioada de 5 zile, cu rate crescând de la 31.000 celule/zi (ziua 1) la 78.000 celule/zi (ziua 3) și 136.000 celule/zi în ziua 5 (Figura 1B).

Evaluarea statistică a datelor prezentate aici a fost efectuată cu software de analiză (de exemplu, SigmaPlot 14). ANOVA urmat de testul Fischer LSD a fost utilizat pentru a compara mediile între grupurile experimentale. Toate datele sunt prezentate ca SD medie a cel puțin 3 experimente independente. Rezultatele au fost la nivelul P Figura 1 : Cuantificarea celulelor care recrutat în dopuri de gel derivate din dermembrana subcutanată din subsol voi. (A.) Numere absolute de celule pentru dopuri de gel cu membrană de subsol încărcate cu vehicul (bare deschise) și MCP-1 (bare închise). (B.) Numărul de celule recrutate de MCP-1 în dopuri de gel derivate din membrană de pivniță a fost calculat ca diferență în numărul de celule între dopurile încărcate cu MCP-1 și cele încărcate de vehicul. Rezultatele sunt afișate ca sD medie (n = 4). Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

chimiotactice

Figura 2 : Analiza populațiilor de celule recrutate în dopuri de gel derivate din membrana bazală prin analiza unicelulară Western blot erau. (A + B) Exemple reprezentative pentru analiza scWB a unui vehicul încărcat (Control) și un conector lende MCP-1 (MCP-1) izolat de la un șoarece la trei zile după injectare sunt prezentate. Cipuri etichetate cu anticorpi împotriva CD45, CD11b și F4/80 urmate de anticorpi fluorescenți secundari, așa cum este descris în protocol. Intensitatea fluorescenței benzii marcate pentru fiecare celulă individuală este prezentată ca zona vârfului. (C + D) Populațiile de celule au fost identificate ca monocite (CD11b + F4/80 -,), macrofage (CD11b + F4/80 + plus CD11b - F4/80 +), sau ca leucocite nonmonocitice (CD45 +,). Celulele rămase au fost denumite „altele” (). Rezultatele sunt prezentate ca media sD (n = 3). Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

monocite

Figura 3 : Conținutul de monocite și macrofage ale dopurilor de gel de la Dererampen. Analiza cantitativă a nivelurilor recrutate de monocite și macrofage în dopurile încărcate cu vehicul și MCP-1 care au fost îndepărtate în zilele 1, 3 și 5 după injectare. Valorile sunt exprimate ca procent din populația totală de celule (A + B) și în număr absolut de celule per conector (C +D.) este afisat. Rezultatele sunt prezentate ca media sD (n = 3). Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Discuţie

Există o serie de limitări ale testului de luat în considerare. În primul rând, manipularea șoarecilor, inclusiv anestezia, injectarea soluțiilor derivate din membrana bazală și rinzul chirurgical, necesită practică pentru a genera dopuri individuale și date reproductibile. În al doilea rând, în timp ce majoritatea celulelor care sunt recrutate în mufele încărcate cu MCP-1 sunt monocite și macrofage, un număr semnificativ nu. Acest lucru poate afecta interpretarea altor teste analitice, care nu sunt bazate pe o singură celulă, efectuate pe această populație de celule. Deoarece condițiile de liză celulară pentru scWB sunt ușoare, distanțele de migrație ale proteinelor se pot abate de la WB standard și nu se corelează cu dimensiunea proteinei. Prin urmare, atât liza celulară, cât și timpii de funcționare trebuie să fie validați pentru fiecare proteină nouă de testat și pentru fiecare anticorp primar.