De la clinica medicală cu accent pe hematologie, oncologie și imunologie tumorală - PDF
De la Clinica Medicală cu accent pe hematologie, oncologie și imunologie tumorală a Facultății de Medicină Charité Universitätsmedizin Berlin DISERTARE Senescența indusă de oncogen în secvența adenom colorectal-carcinom și funcția sa de predictor pentru răspunsul la 5-FU în situația în primul rând metastatică pentru a realiza grad academic Doctor medicinae (Dr. med.) prezentat la Facultatea de Medicină Charité Universitätsmedizin Berlin de Anja Haugstetter din Stuttgart-Bad Cannstatt
Recenzent: 1. Prof. Dr. med. C. A. Schmitt 2. Prof. Dr. med. F. R. Greten 3. Prof. Dr. med. L. Zender Data doctoratului: 18 noiembrie 2011 2
Cuprins 1 Introducere 6 1.1 Adenocarcinom colorectal 6 1.1.1 Epidemiologia adenocarcinomului colorectal 6 1.1.2 Factori de risc pentru dezvoltarea carcinomului colorectal 6 1.1.3 Factori relevanți din punct de vedere pronostic 7 1.1.4 Secvența adenom-carcinom 8 1.1.5 Rasul oncogenului 10 6 Terapia adenocarcinomului colorectal 11 1.2 Apoptoza 11 1.3 Senescența 12 1.3.1 Caracteristicile senescenței 13 1.3.2 Markerii potențiali pentru senescență 15 1.3.3 Semnificația senescenței induse de oncogen in vivo 18 1.3.4 Senescența prematură și agenții chimioterapeutici 19 2 Întrebare de cercetare 22 3 Material și metode 23 3.1 Material 23 3.1.1 Linii celulare și linie bacteriană 23 3.1.2 Medii 23 3.1.3 Soluții 24 3.1.4 Plasmide 25 3.1.5 Dispozitive și accesorii 25 3.1.6 Anticorpi 27 3
3.2 Metode 28 3.2.1 Cultură celulară 29 3.2.1.1 Liniile celulare 29 3.2.1.2 Subcultivarea liniilor celulare 30 3.2.1.3 Crioconservarea celulelor 30 3.2.1.4 Numărul de celule, curbele de creștere, viabilitatea 30 3.2.2 Infecția retrovirală 31 3.2.2.1 Plasmidele utilizate 31 3.2. 2.1 Transformarea 31 3.2.2.2 Mini-pregătirea ADN-ului 32 3.2.2.3 Max-pregătirea ADN-ului 33 3.2.2.4 Determinarea fotometrică a concentrației soluției de ADN 33 3.2.2.5 Separarea electroforetică a fragmentelor de ADN 34 3.2.2.6 Transducția 34 3.2. 2.6.1 Transfecție mediată de fosfat de calciu 34 3.2.2.6.2 Infecția celulelor țintă 35 3.2.3 Fixarea și încorporarea parafinelor a controalelor 35 3.2.4 Metode de colorare 37 3.2.4.1 Imunohistochimie 37 3.2.4.2 Colorare fluorescentă a SAHF 39 3.2.4.3 SA-beta-Gal - Colorare 39 3.2.4.4 Evaluarea colorării țesutului 40 3.2.5 Măsurători citometrice de flux: Profil BrdU-PI 40 3.2.6 Selectarea pacienților și date de urmărire 41 3.2.7 Analiza mutației oncogenei K-ras 42 3.2.8 Statistici 42 4
4 Rezultate 43 4.1 Producerea controalelor senescenței din fibroblaste 43 4.2 Senescența în țesuturile criogenice 47 4.3 Senescența în țesuturile parafinice 53 4.4 Evaluarea relevanței clinice 65 5 Discuția 73 5.1 Compararea cu literatura curentă 74 5.2 Observații critice 80 5.3 Perspectiva 81 6 Rezumatul 83 7 Anexa 85 7.1 Bibliografie 85 7.2 Lista figurilor 95 7.3 Lista tabelelor 96 7.4 Lista abrevierilor 97 7.5 Lista publicațiilor 99 8 Mulțumiri 100 9 Curriculum Vitae 101 10 Afidavit 103 5
Inițierea leziunilor ADN la care celula reacționează cu senescență, tumora premalignă se oprește în creșterea sa. Țesutul se poate proteja de progresia către tumora malignă. Figura 5: Senescență indusă de terapie. Rolul senescenței în tumorile premaligne și maligne. Activarea oncogenului în celulele normale duce la o hiperproliferare inițială. Deteriorarea ADN-ului rezultat activează un program de supresie a tumorii, care oprește creșterea tumorii premaligne. Se găsesc trăsături tipice ale senescenței. Dacă există o mutație care oprește programul de supresie a tumorii sau, alternativ, o scădere a factorilor însoțitori care favorizează senescența, tumora începe să crească din nou și se dezvoltă malignitatea invazivă. Dacă tumoarea malignă este tratată cu agenți chimioterapeutici, dacă răspunde, este condusă la apoptoza sinuciderii celulare sau din nou la senescența de arestare a ciclului celular terminal. Ce se întâmplă exact în termeni biologici moleculari în timpul progresiei unei tumori premaligne într-un carcinom nu este clar. Pe de o parte, ar putea fi concepută o mutație a efectorului 20
Inițierea căii de semnal a mașinilor de senescență, de ex. o mutație p53, cu care tumora premalignă începe să prolifereze invaziv într-un mod necontrolat. Un model alternativ vede senescența în leziunea premalignă ca o expresie a activității oncogene împreună cu alți factori care promovează senescența. Acești factori ar putea include condiții autonome celulare și, eventual, locale non-autonome celulare, cum ar fi de ex. densitatea vasculară, prezența hipoxiei și citokinele secretate de macrofage. Progresia către carcinom invaziv este apoi explicată prin presiunea pro-senescentă mai mică care permite depășirea OIS. O diferență crucială în acest model este că celulele rămân genetic capabile de senescență. Pot exista încă câteva zone senescente mici în tumora malignă care s-a format. Dacă unul este tratat acum cu agenți chimioterapeutici, tumora se poate aresta din nou în senescență sau poate intra în apoptoză dacă există un răspuns la terapie. 21
Material și metode 3 Material și metode 3.1 Material Produsele chimice de laborator au fost furnizate de Merck (Germania), Biochrom (Germania), Sigma (Germania), Roth (Germania), Serva Electrophoresis (Germania), New England Biolabs (Germania) și DAKO (Danemarca) Gibco (SUA) a obținut cel mai înalt nivel de calitate. Dispozitivele și accesoriile, precum și materialele de cultură celulară au fost obținute de la Falcon (Germania), Eppendorf (Germania), Nunc (Germania) și Techno Plastic Products (Elveția) ca articole sterile de unică folosință. Materialele refolosibile au fost autoclavizate. Produsele chimice și materialele de la alți producători sunt prezentate în următoarea listă. 3.1.1 Linii celulare și linie bacteriană IMR90 American Type Culture Collection (ATCC), SUA (CCl-186) fibroblaste pulmonare umane diploid aderente de la un făt vechi de 16 săptămâni Phoenix eco Nolan Lab, SUA 135 linie de celule renale embrionare umane aderente 293T E. coli (DH5α) Invitrogen, Germania 3.1.2 Mediu mediu pentru cultivarea celulei (depozitare la 4 ° C) Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM + 4500 mg/l glucoză + L-glutamină + piruvat) + 10-15% FBS + 100 U/ml mediu de înghețare penicilină-streptomicină ( depozitați la 4 C) FBS (ser de vițel fetal) + 10% DMSO Bulion de lizogenie (LB) mediu 10 g/l triptonă + 5 g/l NaCI, (posibil + ampicilină) 23
Material și metode 3.1.3 Soluții PBS (soluție salină tamponată cu fosfat) (depozitați la temperatura camerei) 8 g NaCl (137 mm) + 0,2 g KCl (2,7 mm) + 1,44 g Na 2 HPO 4 (10 nm ) + 0,24 g KH 2 PO 4 (2 mm) completează până la 800 ml cu dh 2 O; se titrează la pH 7,4 până la 1 l se umple cu soluție dh 2 O S1 (mini-preparat) (se păstrează la 4 C) 50 mm glucoză + 25 mm Tris-HCI (ph 8,0) + 10 mm EDTA (ph 8, 0) în soluție dh 2 O P1 (mini preparat) (depozitați la 4 C) Soluție S1 + 100 µl/ml RNază A adăugați proaspăt în fiecare caz soluție S2 (mini preparat) (depozitați la temperatura camerei) 0,2 N NaOH + 1% SDS în adică 2 O se prepară proaspăt de fiecare dată soluție S3 (mini-preparat) (se păstrează la 4 C) 60 ml acetat de potasiu 5 M + 11,5 ml acid acetic + 28,5 ml adică 2 O 50 x TAE (depozitați la RT) 242 g Trisbase + 57,1 ml acid acetic glacial + 100 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0) SA-beta-Gal-PBS (depozitați la RT) PBS + 1 mm MgCl 2 titrat la pH 6 pentru țesuturile umane SA-beta-Gal fixativ SA-beta-Gal-PBS + 2% paraformaldehidă + 0,25% glutaraldehidă 24
Material și metode Soluție X-Gal SA-beta-Gal-PBS + 1 mg/ml 5-brom-4-clor-3-indolil-ß-D-galactozid + 50 µl/ml 20 x soluție de cianură de potasiu 20 x soluție de cianură de potasiu (la 4 C) 820 mg K 3 Fe (CN) 6 + 1,050 g K 4 Fe (CN) 6 x 3h 2 0 umpleți până la 25 ml cu PBS Mowiol 4-88 (păstrați alicote la -20 C, preîncălziți la 37 C înainte de utilizare ) Se amestecă 8 g Mowiol + 40 ml Tris-HCI 0,2 M (pH 8,5) la 50-60 C; După răcire: +20 ml glicerol + 2,5% DABCO QIAamp DNS Mini Kit Quiagen, Germania BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit 3130 Genetic Analyzer, Biosystems, SUA 3.1.4 Plasmide Plasmid Backbone Insert Origine pbabe-ras pbabe-puro H-rasV12 Scott Lowe pbabe-empty pbabe-puro - Scott Lowe 3.1.5 Dispozitive și accesorii BioFotometru 8,5 mm Eppendorf, Germania Citometru de flux (sortare celulă activată cu fluorescență, FACS)
Materiale și metode Alimentare electroforeză E835 Consort, Belgia Dispozitiv de deshidratare ASP300 Leica, Germania Incubator Steri-cult 200 Labotect GmbH, Germania Consilier Plasmid Maxikit Invitek, Germania Camera Inteq, Germania Kryostat FrigoCut 2800 Reicher-Jung, Germania Microtom RM2035 Leica, Germania Microscop Krüss, Germania Microscop pentru colorare cu fluorescență Zeiss Axioplan Mr. Frosty box de congelare (1 C pe minut) Nalgene Labware Neubauer camera de numărare îmbunătățită Adâncime 0,1 mm Casete de parafină Superior Marienfeld, Germania Medite, Germania Banc steril Kendro HeraSafe Heraeus, Germania Rezervor de azot Thermolyne 6Plus Locator Thermo Scientific, Germania Thermomixer comfort 1,5 ml Eppendorf, Germania Dulap de încălzire Linie funcțională Heraeus, Germania Centrifugă Eppendorf 5417 R Eppendorf, Germania Centrifugă Heraeus Megafuge 1.0 R Heraeus, Germania 26
Material și metode 3.1.6 Antigen de origine antigenă Companie scindată caspază 3/Asp175 Rabbit Cell Signaling Technology, SUA (# 9661) H3K9me 3 Rabbit Abcam, SUA (ab8898) HP1 γ mouse Chemicon, SUA (MAB3450) Ki67 mouse DAKO, Danemarca (M7240 ) P16 Mouse Novocastra, UK (NCL-p16-432) P53 Mouse Oncogene, Germany (OP43, AB-6) PAI-1 Mouse Novocastra, UK (Ncl-PAI-1) Phospho-Chk2 (Thr68) Rabbit Cell Signaling Technology, SUA (# 2661) Phospho-Erk 1/2 (Thr202/Tyr204) Rabbit Cell Signaling Technology, SUA (# 4376) Phospho-H2A.x (Ser139) Rabbit Cell Signaling Technology, SUA (# 2577) Phospho-P53 (Ser15) Rabbit Cell Signaling Technology, SUA (# 9284) Mouse PML DAKO, Danemarca (M7202) Fluorescent Secondary Antibodies Anti-Mouse IgG Goat GIBCO Invitrogen, Germania, (Alexa Fluor 594; A21121) Fluorescent Anti-BrdU Mouse GIBCO Invitrogen, Germania (MD5300 ) Al doilea anticorp anti-iepure Donkey Dianova, Germania LSAB-AP Kit Dako, Danemarca (K0689) LSAB-HRP Kit Dako, Danemarca (K0690) 27
Material și metode 3.2 Metode Figura 6 oferă o prezentare generală a configurării experimentale și a calendarului etapelor individuale Figura 6: Prezentare generală a metodei. Prezentare generală a etapelor individuale ale experimentelor. Pasul A: Producerea controalelor pentru fenotipul senescent din fibroblaste IMR90. IMR90 au fost infectate retroviral cu ras sau vector gol. După finalizarea selecției, au fost lăsați în cultură timp de șase zile. În acest timp a apărut fenotipul senescent al IMR90ras, în timp ce golul IMR90 a continuat să prolifereze. Au fost efectuate diferite teste de senescență, cum ar fi curbele de creștere, testul SA-beta-Gal și analiza ciclului celular. Celulele infectate au fost congelate rapid ca pelete de celule fie pentru criocontrole, fie deshidratate pentru controlul parafinei și încorporate în parafină. Pasul B: criocontrolele IMR90 și țesuturile criogenice colorectale (5 țesuturi normale, 12 adenoame, 6 carcinoame) au fost examinate pentru senescență cu testul SA-beta-Gal și detectarea imunohistochimică a Ki67. Pasul C: parafina IMR90 28