De la clinica universitară medicală
1 De la Clinica Universității Medicale Departamentul de Medicină Internă ΙΙΙ al Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Rolul TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N pentru a obține titlul de medic medical al facultății de medicină a Universității Albert-Ludwigs-Freiburg i. Fr. Prezentat în 2010 de născut în Peter Stachon Göppingen
2 Decan: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert Erich Blum Recenzor 1: PD Dr. Andreas Zirlik al doilea recenzor: PD Dr. Michael Hoffmann Anul doctoratului: 2011
4 Cuprins TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză Genotiparea șoarecilor: izolarea ADN Genotiparea șoarecilor: reacție în lanț a polimerazei (PCR) Transplantul de celule hepatice fetale la șoareci Procesul de transplant de celule hepatice fetale Generarea celulelor stem donatoare Genotiparea donatorilor: Qiagen-Kit Iradierea mieloablativă a șoarecilor primitori și transplant Transplant de celule stem hepatice fetale la șoareci CD45.1. Studiu de hrănire. Recoltare de sânge retroorbital înainte de dietă Colorare pentru a colora conținutul de grăsime al peretelui arterial Colorare imunohistochimică MAC-3 pentru macrofage din peretele arterial Colorare imunohistochimică a celulelor helper CD4 + T Colorarea imunohistochimică a mușchilor netezi a K Colagen: Picrosirius Colorare roșie Evaluare Fotografierea secțiunilor Evaluarea rădăcinii aortice Evaluarea arcadelor aortice și aortei abdominale. 42
8 Introducere TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză Fig. 1: În Europa, bolile cardiovasculare sunt cea mai frecventă cauză de deces Atât bărbații (de sus), cât și femeile (de mai jos) bolile sistemului cardiovascular sunt cea mai frecventă cauză de deces. Majoritatea acestor boli se bazează fiziopatologic pe ateroscleroză. Sursă:
52 Rezultatele TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză După o fază de reconstituire de patru săptămâni, sângele a fost prelevat de la șoareci și acest lucru a fost evaluat folosind FACS pentru reconstituirea CD45.1 prin colorare dublă cu CD45.1-APC și CD45.2-PE. Acest experiment arată o reconstituire reușită: 95,2% și 95,0% din celulele sanguine au fost înlocuite cu celulele stem obținute din ficatul fetal. Mai mult, s-a demonstrat că limfocitele B CD19-pozitive, limfocitele T CD3-pozitive și leucocitele CD11b-pozitive, cum ar fi monocitele, macrofagele, granulocitele și celulele naturale ucigătoare, poartă markerul de suprafață CD45.1 după transplantul de celule hepatice fetale. Dacă se analizează mai atent aceste subgrupuri, se vede că celulele CD11b și CD19 pozitive au fost înlocuite de celulele donatoare într-o măsură mai mare de 99%. Doar în grupul de celule T există aproximativ 4% din celulele destinatarului, care sunt celule celulare de memorie T cel mai probabil (Fig.7).
53 Rezultate TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză Fig. 7: reconstituirea cu succes a celulelor sanguine periferice prin transplantul de celule hepatice fetale LDLR -/- șoareci (CD45.2 pozitiv/cd45.1 negativ, A) au fost iradiați mieloablativ (2x450cGy) și cu celule hepatice fetale din zile făturile vechi (CD45.2 negativ, CD45.1 pozitiv, B) reconstituite. 4 săptămâni mai târziu, șoarecii au fost sângerați și s-a efectuat o analiză FACS a animalelor transplantate pentru markerii de suprafață CD45.1 și CD45.2 (de exemplu, C.
59 rezultate TRAF2 +/+/LDLR -/-: mm2, 0,53 ± 0,18 +/+ grup de control (TRAF2/LDLR De asemenea TRAF2- celule stem heterozigoice reconstituite TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză -/- N = 13, p = +/+ 0,56) comparativ cu -/- la 2 în TRAF2/LDLR: 0,41 ± 0,08 mm, N = 16). Beneficiarii care au avut o dimensiune similară a leziunilor aterosclerotice cu deficit de TRAF2 (TRAF2 -/-/LDLR -/- în TRAF2 +/-/LDLR -/-: 0,48 ± 0,01 mm2, N = 17, p = 0,60, Fig. 12). În plus față de dimensiunea leziunii aterosclerotice, compoziția sa este, de asemenea, de mare interes, deoarece influențează stabilitatea plăcii. Dacă proporția lipidelor din placă este crescută, acest lucru este asociat cu o incidență crescută de rupere a plăcii la om. Cu toate acestea, deficiența TRAF2 nu are nicio influență asupra conținutului de lipide al leziunilor aterosclerotice (Fig. 12). B 0,08 p = 0, p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/în TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/în TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/în TRAF2 +/-/LDLR -/- Colorare pozitivă roșu-ulei-O/dimensiunea întregii leziuni a peretelui vasului (mm 2) A 0,15 p = 0,54 p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/în TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/în TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/în TRAF2 +/-/LDLR -/- C TRAF2 +/+/LDLR-/în TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/în TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/în TRAF2 +/-/LDLR -/- Fig. 12: Deficiența TRAF2 nu are nici o influență asupra Dimensiunea afectează în continuare conținutul lipidic al leziunilor aterosclerotice
66 Rezultate TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză TRAF6 nu modifică compoziția leziunilor aterosclerotice.În continuare, s-a testat ipoteza dacă TRAF6 are o influență asupra compoziției leziunilor aterosclerotice. La om, acest lucru are consecințe asupra stabilității și, prin urmare, asupra susceptibilității la ruperea unei leziuni aterosclerotice. Prin urmare, conform dietei, au fost pregătite secțiuni histologice care au fost colorate pentru macrofage (Fig. 17A), pentru lipide (Fig. 17B), celule musculare netede (Fig. 17C), colagen (Fig. 17D) și celule T (Fig. 17E) erau. Se pare că deficiența de TRAF6 nu are nicio influență asupra compoziției leziunii aterosclerotice, deoarece nu s-a găsit nicio diferență semnificativă între cele trei grupuri în oricare dintre colorările efectuate.
67 Rezultate TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză A Arie pozitivă Mac-3 (%) p = 0,23 p = 0,52 B Ulei-roșu-O zonă pozitivă (%) p = 0,58 p = 0,98 C α- actină zonă pozitivă (%) p = 0,95 p = 0,16 D picrosirius zona redpositivă (%) p = 0,36 p = 0,66 E 100 CD4 + celule/perete vas p = 0,74 p = 0,21 TRAF6 +/+/LDLR -/- în TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- în TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- în TRAF6 +/-/LDLR -/- 0 Fig. 17: Deficiența TRAF6 schimbă placa Compoziția nu a fost iradiată mieloablativ TRAF6 +/+/LDLR -/- șoarecii au primit TRAF6 +/+/LDLR -/- (bare albe, N = 21) sau TRAF6 -/-/LDLR -/- celule stem (bare hașurate, N = 21). Șoarecii TRAF6 +/-/LDLR -/- au fost reconstituiți cu celule stem TRAF6 -/-/LDLR -/- (bare negre, N = 22). Ulterior, toate grupurile au primit o dietă bogată în colesterol timp de 18 săptămâni, la finalul căreia compoziția leziunilor aterosclerotice din zona rădăcinilor aortice a fost cuantificată prin intermediul colorării imunohistochimice. Rezultatele pentru macrofage (A), lipide (B), celule musculare netede (C), colagen (D) și celule T (E) sunt fiecare reunite și prezentate ca medie ± SEM.
68 Rezultate TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză TRAF6 nu are nicio influență asupra aterogenezei în aorta descendentă și în arcul aortic Deoarece ateroscleroza se poate dezvolta diferit în diferite părți ale sistemului vascular, aorta descendentă până la bifurcație a fost analizată pe o față după colorare de lipide examinate cu ajutorul Oil-Red-O. Așa cum era de așteptat, nu au existat diferențe în aorta abdominală între animalele cu deficit de TRAF6 (21,0 ± 2,9%, N = 8, p = 0,90) sau competente cu TRAF6 (20,5 ± 2, 6%, N = 8) au fost transplantate celule stem. Beneficiarii TRAF6 +/-/LDLR -/- care au primit celule stem hematopoietice cu deficit de TRAF6 (25,2 ± 2,6%, N = 10, p = 0,23) au avut, de asemenea, o distribuție lipidică similară cu cea a grupului de control (Fig. 18A și B). În arcurile aortice analizate histologic, animalele care au fost transplantate cu celule stem cu deficit de TRAF6 au, de asemenea, dimensiuni ale plăcii similare cu cele din grupul de control (TRAF6 -/-/LDLR -/- în TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,012 ± 0,003 mm 2, N = 18, p = 0,85, TRAF6 -/-/LDLR -/- în TRAF6 +/-/LDLR -/- (0,020 ± 0,006mm 2, N = 16, p = 0,85, TRAF6 +/+/LDLR -/- în TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,013 ± 0,003 mm 2, N = 20, Fig. 18 C și D).
69 Rezultate TRAF2 și TRAF6 în ateroscleroză Fig. 18: Deficitul de TRAF6 modifică distribuția lipidelor în aorta abdominală și dimensiunea leziunilor aterosclerotice în arcada aortică, nu iradiate mieloablativ TRAF6 +/+/LDLR -/- șoarecii au primit TRAF6 +/+/LDLR -/- (bare albe, N = 8) sau TRAF6 -/-/LDLR -/- celule stem (bare hașurate, N = 8). Șoarecii TRAF6 +/-/LDLR -/- au fost reconstituiți cu celule stem TRAF6 -/-/LDLR -/- (bare negre, N = 10). După aceea, toate grupurile au primit o dietă bogată în colesterol timp de 18 săptămâni, la sfârșitul căreia a fost analizată ateroscleroza din aorta abdominală după colorarea cu ulei-roșu-o împotriva lipidelor pe față. Rezultatele cumulate sunt date ca Oil-Red-O pe suprafața totală ± SEM (A); aortele reprezentative sunt fotografiate fără mărire în rândul inferior (B). După dietă, secțiunile histologice ale arcurilor aortice au fost realizate și colorate cu ulei-roșu-O. Mărimile grupate ale leziunilor aterosclerotice ± SEM sunt prezentate în rândul superior (C), mai jos sunt secțiuni histologice reprezentative colorate cu ulei-roșu-O în mărire 4x (D).