De la Institutul pentru Zootehnie și Creștere Universitatea din Hohenheim Departamentul de Zootehnie și
De la Institutul pentru Zootehnie și Creștere Universitatea din Hohenheim Domeniul tematic: Zootehnie și Fiziologie a performanței Prof. Dr. R. Claus Creșterea formării butiratului prin hrănirea amidonului rezistent la porci: Consecințe pentru reglarea mitozei și apoptozei mucoasei colonului Disertație pentru obținerea diplomei de doctor în științe agricole prezentată la Facultatea de Științe Agricole de Joachim Mentschel de la Landshut 2004
De la Institutul pentru Zootehnie și Creștere Universitatea din Hohenheim Domeniul tematic: Zootehnie și Fiziologie a performanței Prof. Dr. R. Claus Creșterea formării butiratului prin hrănirea amidonului rezistent la porci: Consecințe pentru mitoza și reglarea apoptozei mucoasei colonului Disertație pentru obținerea diplomei de doctor în științe agricole prezentată la Facultatea de Științe Agricole de Joachim Mentschel de la Landshut 2004
Prezenta lucrare a fost acceptată pe 12 martie 2004 de către Facultatea de Științe Agricole de la Universitatea din Hohenheim ca disertație pentru obținerea diplomei de Doctor în Științe Agricole. Ziua examenului oral: 25 martie 2004 Proscan I: Prof. Dr. K. Stahr Raportor, examinator 1: prof. Dr. R. Claus Coraportor, examinator 2: Prof. Dr. H. Schenkel examinator 3: Prof. Dr. R. Mosenthin
Revizuirea literaturii 2 Revizuirea literaturii 2.1 Prezentare generală a sistemului digestiv al porcului Sistemul digestiv al porcului este împărțit în cap și trunchi. Intestinul capului este format din cavitățile nazale, orale și faringiene. Trunchiul poate fi împărțit în foregut (esofag și stomac), intestinul mijlociu sau subțire (duoden, jejun și ileon), rectul sau intestinul gros (cec, colon și rect) și anus (Liebich, 1998). Structura intestinului trunchiului este prezentată schematic în Fig. 1. Fig. 1: Reprezentarea schematică a intestinului trunchiului la porci (după Koch și Berg, 1990) 2I
Revizuirea literaturii Lungimea întregului intestin la porci este de 20-27 m, de aproximativ 15 ori lungimea corpului. Duodenul măsoară aproximativ 0,95 m și întregul intestin subțire cu jejun și ileon aproximativ 15-20 m. Lungimea intestinului gros este în jur de 6 m, cea a colonului în jur de 5 m (Loeffler, 1991; Bucher & Wartenberg, 1991). 2.1.1 Principiile morfologice ale tractului gastro-intestinal și caracteristicile sale speciale Toate secțiunile intestinului trunchiului au un plan de bază similar (Liebich, 1998), dar există diferențe considerabile în ceea ce privește structura peretelui lor (Fig. 2). Intestinul subțire este format din numeroase cripte și vilozități. Criptele sunt mai scurte decât cele ale intestinului gros. În schimb, nu există viliuni în intestinul gros. Caracteristică este formarea de cripte (glandulae intestinale), acestea nu sunt ramificate și se află aproape una de alta. Enzimele sale digestive proprii nu sunt excretate din mucoasa colonului. În plus, intestinul gros are capacitatea de a excreta substanțe slab solubile, cum ar fi metalele. În plus, spre deosebire de intestinul subțire, mișcările nu numai peristaltice, ci și antiperistaltice sunt fiziologice în intestinul gros (Bucher și Wartenberg, 1991). Fig. 2: Diferite structuri de perete ale intestinului subțire și ale intestinului gros (după Potten, 1992) 3
Revizuirea literaturii 2.1.2 Particularitățile morfologice ale colonului Colonul se dezvoltă în timpul embriogenezei din mijloc și rect. Colonul ascendent și colonul transvers proximal se dezvoltă din intestinul mediu, iar colonul transvers distal și colonul descendent apar din rect. În plus față de această dezvoltare diferită, există și diferențe fiziologice digestive, astfel încât locul principal de fermentare se află în zona proximală, dar poate fi, de asemenea, mutat distal în funcție de substratul preluat. Mai mult, pulpa digestivă este din ce în ce mai îngroșată în zona distală. Din aceste motive, colonul este denumit colon proximal și distal în această lucrare. Partea proximală constă din colonul ascendent și zona proximală a colonului transvers, zona distală a colonului transvers distal și colonul descendent. 2.1.2.1 Construcția generală a peretelui colonului Planul de construcție de bază al colonului constă din diferite țesuturi stratificate (Fig. 3), se numesc tunica mucoasă, tela submucoasă, tunica muscularis, tela subserosa și tunica seroasă de la lumen spre exterior. Fig. 3: Secțiune transversală prin colon (Liebich, 1998) 4I
Revizuirea literaturii 2.2 Sarcini ale tractului gastro-intestinal Sarcina principală a tractului gastro-intestinal este descompunerea alimentelor ingerate în componentele sale într-o asemenea măsură încât să poată fi absorbite în interiorul corpului. Procesul digestiv începe cu o defalcare mecanică a componentelor alimentare din cavitatea bucală. După înghițirea alimentelor, carbohidrații, proteinele și grăsimile sunt digerate. Digestia din intestinul mediu are loc prin intermediul enzimelor. O imagine de ansamblu asupra propriilor enzime ale organismului în timpul descompunerii principalelor substanțe nutritive este prezentată în Fig. 5. Fig. 5: Prezentare generală a propriilor enzime ale organismului în timpul descompunerii principalelor substanțe nutritive (conform lui Simon, 1995) Eficacitatea enzimelor intestinului subțire din intestinul gros scade continuu. În schimb, bacteriile intestinale și protozoarele care descompun carbohidrații și proteinele preiau digestia componentelor alimentare rămase în intestinul gros. Pe lângă absorbția mineralelor și a apei, sarcinile intestinului gros sunt sinteza vitaminelor B și K și în principal 7
Prezentare generală a literaturii Tab. 3: Raporturile molare ale acetatului, propionatului și butiratului după 24 de ore de incubație a fecalelor umane cu carbohidrați diferiți (conform Cummings & Macfarlane, 1997) Randamentul substratului SCFA (%) Raporturile molare (%) acetat propionat butirat amidon 49 62 15 23 tărâțe (grâu, 40 64 16 20 ovăz) fructooligosaccaridă - 78 14 8 pectine 39 80 12 8 alte NSP 38 63 22 8 inclusiv: gumă de guar arabinogalactan 62 43 59 57 27 31 11 11 componente alimentare precum celuloză, hemiceluloză, pentozani (Berggren et al., 1993; Bourquin și colab., 1993; Knudsen și colab., 1993) duc la o ușoară fermentare a butiratului, în timp ce se obțin concentrații crescute de butirat, în special cu amidonuri rezistente. Tab. 4: Rapoarte molare de acetat, propionat și butirat după 24 de ore de incubare a fecalelor de porc cu amidon diferit (conform Martin și colab., 1998) Rapoarte molare substrat (%) acetat propionat butirat amidon de grâu brut 56 25 17 amidon de porumb brut 62 21 16 amidon de mazăre crud 62 21 15 amidon de porumb amilom crud 47 28 23 retrogradat 54 28 14 amidon de porumb amilom amidon de cartof crud 55 19 25 11
Revizuirea literaturii privind menținerea homeostaziei tisulare. Este strâns legată de mitoză, deoarece dacă numărul de celule dintr-un țesut rămâne același, la fel de multe celule se formează pe măsură ce se pierd prin moartea celulelor (Kerr și colab., 1972). În consecință, mecanisme bine definite pentru reglarea pierderii celulare trebuie să existe în țesuturile cu producție constantă de celule (Ansari și Hall, 1992). Sarcinile lor sunt de a elimina celulele inutile, deteriorate sau infectate (Thompson, 1995). Erorile în apoptoză pot duce la diferite imagini clinice. Dacă rata mitotică rămâne aceeași, o creștere duce la atrofia țesuturilor. Pe de o parte, activarea mecanismelor de control pro-apoptotic poate duce la degenerescența țesuturilor (Que & Gores, 1997), pe de altă parte, erorile în apoptoză facilitează transformarea țesutului normal în țesut neoplazic. Din aceste motive, sunt discutate strategiile farmacologice în ceea ce privește influențarea apoptozei. Astfel, inhibarea apoptozei celulelor epiteliale ar putea îmbunătăți procesele de reînnoire și reparare a țesuturilor în tractul gastrointestinal, în timp ce inducerea apoptozei în țesuturile maligne ar putea avea un beneficiu terapeutic ridicat (Que & Gores, 1997). 2.4.1 Diviziunea celulară: Mitoza Procesul de diviziune celulară, prin care se creează o nouă celulă cu același număr de cromozomi ca și în celula originală, se numește mitoză. În mitoză, fiecare cromozom se împarte în două părți egale care se deplasează către capetele opuse ale celulei. După divizarea celulară, fiecare dintre cele două celule fiice are atunci același număr de cromozomi și gene ca celula originală. Celulele unicelulare construite simplu și unele specii multicelulare se înmulțesc prin mitoză; În plus, ființele vii cresc prin acest proces (hiperplazie) și celulele uzate sunt înlocuite. Acest lucru este în contrast cu creșterea celulelor (hipertrofie), care trebuie înțeleasă doar ca o creștere a masei celulare sau a dimensiunii celulelor. În mucoasa tractului gastro-intestinal, enterocitele ies întotdeauna din celulele stem care se află în zonele inferioare ale criptei (Bach și colab., 2000). Pentru a identifica o celulă proliferantă, trebuie detectate modificări specifice, cum ar fi produsele genetice care sunt asociate cu proliferarea. Ca reprezentanți ai acestor gene legate de proliferare sunt u. A. au discutat despre oncogene. Ciclul celular cronologic (Fig. 7) are o mare importanță pentru identificarea mitozei. Aceasta este împărțită în patru faze (G1, S, G2 și M). În timpul S Pha- 14 I
Revizuirea literaturii se realizează sinteza ADN-ului, în timpul mitozei fazei M cu divizarea cromozomilor. În fazele G1 și G2 (faze gap), se fac pregătirile pentru procesele din fazele ulterioare S și M. Celulele care nu parcurg ciclul celular se află în faza G0. Începutul mitozei MR G2 G0 G1 S Începutul sintezei ADN Fig. 7: Reprezentarea schematică a ciclului celular Detectarea mitozei poate fi determinată prin intermediul anumitor markeri, cum ar fi PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) și prin detectarea antigenului nuclear (Ki67) (Potten & Loeffler, 1990). Proteina PCNA este sintetizată în celule care se divid. Anticorpii direcționați împotriva acestei proteine reacționează cu celule care se divid, inclusiv celule tumorale, dar nu cu celule în faza de repaus (Mathews și colab. 1984). Anticorpul Ki67 detectează un antigen nuclear care este prezent în celulele proliferante, dar nu și în celulele în repaus. Celulele din fazele ciclice, inclusiv G1, sunt Ki67 pozitive, în timp ce celulele din faza G0 nu exprimă antigenul (Baisch & Gerdes 1990). 15
Prezentare generală a literaturii Fig. 10: Reprezentarea schematică a apoptozei (conform lui Kerr, 1993) 2.4.4.2 Cursul apoptozei Apoptoza poate fi inițiată folosind diferite mecanisme de control (Fig. 11). În acest context, trebuie făcută o distincție între calea apoptozei mediată de receptor și calea mitocondrială. 21
Revizuirea literaturii Calea apoptozei mediată de receptori este inițiată prin receptori precum CD95. Legarea ligandului CD95 la CD95 induce complexul semnal, care recrutează molecule de procaspază 8 prin intermediul FADD (proteina din domeniul morții asociate cu Fas) și, prin urmare, este responsabilă pentru activarea caspazei 8 (Hengartner, 2000). Mitocondriile joacă un rol central în controlul apoptozei. Calea mitocondrială poate fi declanșată de factori extracelulari sau de deteriorarea ADN-ului. Proteinele familiei Bcl-2 sunt implicate în acest mecanism de reglare. Reprezentanții pro- și anti-apoptotici ai acestei familii intră în contact la mitocondrii și controlează eliberarea diferitelor molecule, cum ar fi citocromul c, care, împreună cu apaf-1 și procaspaza 9, poate duce la activarea caspazelor efectoare. Alte mecanisme detaliate prezentate în diagramă nu sunt discutate în continuare în această lucrare; explicații mai detaliate pot fi găsite în publicația Hengartner (2000). Fig. 11: Schema celor mai importante căi de apoptoză (stânga: cale de apoptoză mediată de receptor; dreapta: cale de apoptoză mitocondrială, conform lui Hengartner, 2000) 22 I.
Prezentare generală a literaturii Membrii familiei bcl-2 Eliberarea citocromului c mitocondriei Activarea cascadei caspazei Apoptoza Fig. 12: Modelul cascadei apoptozei prin Bcl-2, mitocondriile, citocromul c și caspazele 2.4.5.1 Proteine de reglare a apoptozei: familia Bcl-2 Bcl-2 a fost utilizată ca protooncogen identificat. Gena a fost descoperită pentru prima dată în limfomul cu celule B. Experimentele pe linii celulare murine au arătat, de asemenea, un efect al bcl-2 asupra apoptozei (Vaux și colab., 1988). În timp ce Bcl-2 se găsește în multe țesuturi fetale, în țesuturile adulte această proteină se exprimă în principal în celule care se divid și diferențiază rapid. În investigații ulterioare, s-au găsit o serie de gene care au secvențe omologice cu bcl-2 (Yang și Korsmeyer, 1996; Reed, 1997). Caracterizarea secvenței de aminoacizi, efectul biologic și funcția au dus la diferite observații. În consecință, familia proteinelor Bcl-2 include atât Ver 25
Revizuirea literaturii Bcl-2, Bcl-X-L, Bid sau de unul singur (Sattler și colab., 1997). Bax contracarează proteina anti-apoptotică Bcl-2; cu cât concentrațiile de Bax sunt mai mari în comparație cu Bcl-2, cu atât efectul său este mai mare. Raporturile relative ale homodimerilor Bax/Bax, heterodimerilor Bcl-2/Bax și homodimerilor Bcl-2/Bcl-2 sunt cruciale pentru executarea apoptozei. Dacă predomină homodimerii Bax, atunci apare moartea celulară; o predominanță a heterodimerilor Bax/Bcl-2 tinde să ducă la supraviețuirea celulelor (Sato și colab., 1994). Cu toate acestea, s-a demonstrat și în unele studii că, indiferent de gradul de dimerizare, Bcl-2 și Bcl-x pot inhiba apoptoza sau că Bax poate promova și apoptoza (St Clair și colab., 1997; Zha și Reed, 1997) (Fig. 13). În plus, efectul pro-apoptotic al lui Bak pare să fie independent de heterodimerizarea cu Bcl-X-L și Bcl-2 (Simonian și colab., 1997). a: bax bcl-2 bcl-2 bax b: Fig. 13: Diagrame care arată interacțiunea proteină-proteină a membrilor familiei bcl-2 (a: modificat din Mathers, 1998; b: Sato și colab., 1994) 27