Disertație. pentru obținerea diplomei academice. Dr. med. la facultatea de medicină. al Universității din Leipzig
1 Ingineria țesuturilor unui țesut cardiac tridimensional utilizând celule stem mezenchimale și examinarea histologică a țesutului pentru integrare și diferențiere celulară într-un model de șobolan in vivo Disertație pentru obținerea diplomei academice Dr. med. la Facultatea de Medicină a Universității din Leipzig Trimis de: Cathleen Spath Data nașterii, locul nașterii:, Bad Frankenhausen Completat la: Heart Center Leipzig Supervizor: Prof. Dr. med. Stefan Dhein Rezoluție privind acordarea titlului de doctor de la:
2 Cuprins Descriere bibliografică Lista abrevierilor v vi 1 Introducere Context Tipuri alternative de celule pentru ingineria țesutului cardiac Caracterizarea MSC Plasticitatea MSC Utilizarea MSC în medicina regenerativă cardiacă Rol dublu al MSC în dezvoltarea tumorilor Întrebări și obiective Materiale Dispozitive și ajutoare Ustensile de laborator Produse chimice și biochimice Medicamente și Substanțe chimice pentru experimente pe animale Testarea animalelor Celule Informații producător: cmscs Substanțe chimice pentru histologie Anticorpi primari Anticorpi secundari Anticorpi marcați pentru FACS Compoziția mediilor Soluții generale Soluții pentru histologie Metode Linii MSC utilizate Izolarea celulelor stem mezenchimale din măduva osoasă adultă a șobolanului (smsc) Anestezie a șobolanilor Izolarea și cultivarea smsc-urilor Dezghețarea și cultivarea cmscs Subcultivarea celor două linii MSC Caracterizarea MSC Măsurători citometrice de flux ale MSC Prepararea a probelor Măsurarea probelor pe citometrul de flux ii
4 Cuprins 5 Discuție 71 6 Rezumat 80 Lista figurilor 82 Lista tabelelor 84 Bibliografie 85 Anexe 99 Declarație de autonomie 102 Curriculum Vitae 103 Publicații 104 Mulțumiri 106 iv
6 Lista abrevierilor AEC AK Aqua dest. BSA BMCs BM-MSC BMMNCs CaCl 2 2 H 2 O CEE CD CH 2 O cmsc cmsc-et CSC 3-Amino-9-Ethylcarbazole Anticorpi Apă distilată Ser albumin alb seric Celule de măduvă osoasă (celule de măduvă osoasă nefracționate) celule stem mezenchimale obținute din măduva osoasă mononucleară celule (celule mononucleare ale măduvei osoase) clorură de calciu dihidrat extract de embrion pui cluster de diferențiere formaldehidă Celule stem mezenchimale dobândite comercial din măduva osoasă a șobolanului Țesut prelucrat din celule stem cardiace cmsc Cx40 Connexin 40 Cx43 Connexin 43 Cx45 Connexin 45 DAPI DMSO EDTA EGF EHTZ FKS FSC GJIC HCl HE 4,6-diamino-2-fenilindol dimetil sulfoxid etilendiamină tetraacetat Factor de creștere endotelial Inginerie Țesut cardiac Matrice extracelulară fluorescență scanare celulară activată (citometru de flux) Fluoresceină izotiocianat fibroblast factor de creștere făt vitel seric comunicare dispersie acid clorhidric interconectare dispersie -Eosin vi
7 Lista abrevierilor celule IPS induse de celule stem pluripotente HPF câmp de putere mare (1 HPF = 0,1734 mm 2) HS IgG KCl Kg KG KH 2 PO 4 ser de cal Imunoglobulină G Clorură de potasiu Kilogramă Greutate corporală Potasiu dihidrogen fosfat Klf4 Factor asemănător Kruppel 4 MgCl 2 6 H 2 O MSC MSC-ET NaCl NaH 2 PO 4 2 H 2 O NaOH Na 2 HPO 4 2 H 2 O Clorură de magneziu hexahidrat celule stem mezenchimale Țesut prelucrat din celule stem mezenchimale Clorură de sodiu Sodiu dihidrogen fosfat Sodiu hidroxid de sodiu Disfod hidrogen fosfat Oct4 octamer legarea factorului de transcripție 4 P/S PBS RT și penicilină/streptomicină fosfat tamponat salină temperatura camerei eroare standard a celulelor stem mezenchimale autoizolate medii din măduva osoasă a șobolanului Ingineria țesutului din smsc Sox-2 regiunea de determinare a sexului Y (SRY) -box 2 SSC TBS TGFβ TRIS TRITC rpm VEGF partea vwf dispersare tris tampon salin factor de creștere transformant beta Tris (hidroximetil) -aminometan Tetrametil rodamină Iso-tiocianat U rotații pe minut factor de creștere endotelial vascular Factor Von Willebrand vii
16 2 Materiale 2.1 Dispozitive și auxiliare Dispozitive/auxiliare Tip Producător Țară/Ora Dispozitiv de aspirare Cultură celulară/microbiologie NeoLab Heidelberg DE/Heidelberg Autoclavă Varioklav 75T HP Medizintechnik GmbH DE/Oberschleißheim Prosop abdominal cm NOBA Verbandmittel Danz GmbH & Co. KG Ventilator ADS 1000 Engler Engineering Bottle Incubator cu filtru superior Bisturie chirurgicale de unică folosință Nalgene FastCap unitate de filtrare de tip flacon tip BB 16 și 16CU Sigma Aldrich und Chemie GmbH Heraeus Instruments GmbH DE/Wetter US/Hialeah DE/Steinheim DE/Gera BB513, BB511 Aesculap DE/Tuttlingen Dispozitiv de calibrare a presiunii 367 Produse HSE NU/Mașină de încorporat Egersund Țesut de drapaj chirurgical de unică folosință Tek Vip E150/E cm Rancodrope Sakura Finetek Europe BV Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG NL/Alphen aan den Rijn DE/Neuwied Razors de unică folosință Med Compfort AMPri GmbH DE/Stelle Eismaschine 2BE Ziegra-Eismaschinen DE/Isernhagen Citometru de flux de stimulare electrică (FACS) fabricat intern Tehnologie medicală Heart Center Leipzig DE/Leipz II BD DE/Heidelberg Faden Silk Braided SMI BE/St. Vith Waage Microbalance Sartorius BP210D DE/Göttingen Camera PowerShot G5 Canon GB/Middlesex Debitmetru de gaz M-45 Stöckert Instrumente DE/Munich 9
19 2 Materiale Dispozitive/SIDA Tip Producător Țară/Oraș Baie de căldură Tip histologie 24900 Medax Nagel GmbH DE/Kiel Cabină termică M400 Memmert GmbH & Co. KG DE/Schwabach Q-Gard2 EMD Millipore Corporation SUA/Billerica Cultura celulară Tip bancă HS12 Heraeus Instruments GmbH Centrifugă DE/Gera Megafuge 1.0 R Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Tabelul 2.1: Dispozitive și resurse. 2.2 Ustensile de laborator Ustensile de laborator Tip Producător Țară/Ora Banda pentru autoclavare Steri Clin VP-Group DE/Feuchtwangen Ochelari de acoperire mm, mm Carl Roth GmbH & Co. Casete de încorporare K115.1 Carl Roth GmbH & Co. Tuburi KG Eppendorf 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Greiner-Bio-One GmbH NL/Alphen aan den Rijn DE/Karlsruhe DE/Frickenhausen Erlenmeyer balon 2 l Simax US/Sistemul de tratare a apei Elk Grove Village FACS- tuburi cu fund rotund/BD DE/Heidelberg FACS Flow 20 l, BD DE/Heidelberg Falcontubes 15 ml, 50 ml Greiner Bio-One GmbH DE/Frickenhausen Fettstick Dako Pen Dako GmbH DE/Hamburg Umiditate Camera Wolfgang Weckert Labortechnik DE/Filtru Kitzingen 100 µm 2 BD DE/Heidelberg sticlă de sticlă din hârtie pentru filtru Tissue Tek II SA ml, 500 ml, 1000 ml Vogel GmbH & Co. KG Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Gießen DE/Karlsruhe 12
21 2 Materiale Ustensile de laborator Tip Producător Țară/Oraș Sfaturi serologice pentru pipetă Seringi Boluri de cântărire 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml 2 ml, 5 ml, 100 ml, 25 ml mm, mm TPP BD Carl Roth GmbH & Co. KG Flacoane de cultură celulară 75 cm 2 Greiner Bio-One GmbH SUA/St. Louis DE/Heidelberg DE/Karlsruhe DE/Frickenhausen Tabelul 2.2: Ustensile de laborator. 2.3 Produse chimice și biochimice Produse chimice generale Tip Producător Țară/Oraș Etanol denaturat, 99,8% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe HCl 37% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Isopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe KCl Merck KGaA DE/Darmstadt NaCl> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe NaOH> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe metanol> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe TRIS> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Tabelul 2.3: Produse chimice generale. Produse chimice pentru cultura celulară Tip Producător Țară/Oraș Aqua dest. BSA Glucoză monohidrat D + Milli Q Academic System Millipore GmbH Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Schwalbach DE/Steinheim for Microbiology Merck KGaA DE/Darmstadt CaCl 2 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe 14
22 2 Materiale Produse chimice pentru cultura celulară Tip Producător Țară/Oraș HEPES> 99,5% Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim KH 2 PO 4> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe MgCl 2 6 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Na 2 HPO 4 2 H 2 O Merck KGaA DE/Darmstadt NaH 2 PO 4 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe adeziv siliconic Dow Corning 734 Dow Corning Corporation SUA/Midland Silicon Adhesive Sterile Medtronic World SUA/Minneapolis Trypan Blue 0.4% Life Technologies GmbH/Gibco DE/Darmstadt Tabelul 2.4: Produse chimice pentru cultura celulară. Medii de cultură și componente EHT Tip Producător Țară/Oraș Kit de diferențiere adipogeniză Extract de embrion de pui Matrigel (matrice extracelulară) Ser de vițel fetal (FCS) A Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Frozen CE-650-J Sera Laboratories International BD, Merck KGaA/Biochrom GB/Cuckfield DE/Heidelberg DE/Berlin Horse Serum Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Kollagen Tip I coadă de șobolan Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim Kollagenase Type II Merck KGaA/Biochrom DE/Berlin M199 de 1 ori Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt M199 de 2 ori Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt penicilină/streptomicină 5000 UI/ml penicilină, 5000 µg/ml streptomicină Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Tabel 2.5: Medii de cultură și componente EHT. 15