Etichetarea proteinelor Cum să alegeți o etichetă pentru proteina dvs.

Sara Klink

Data publicării: 7/2019; tpub_215

Abstract

Marcarea proteinelor este un aspect important al analizei proteinelor. Abilitatea de a vă eticheta proteina pentru diverse aplicații, inclusiv purificare, teste pull-down, imunoanalize și multe altele vă poate ajuta să definiți funcția proteinelor. Dar ce etichetă ar trebui să alegeți? Acest articol acoperă mai multe opțiuni pentru etichete și reactivi pe bază de reporter sau de afinitate care vă pot ajuta cu experimentele.

Introducere

Proteinele sau polipeptidele fac parte integrantă din funcția celulară. Sunt enzimele care alcătuiesc căi pentru metabolismul energetic, creșterea celulară, semnalizare, ciclul mitotic și moartea celulară. Abilitatea de a izola și detecta proteine specifice ne permite să înțelegem ce proteine fac parte din complexe mai mari, ce proteine interacționează și rolul lor în funcția celulară și în ceea ce privește boala. O modalitate de a examina funcția unei proteine este prin adăugarea unei etichete la proteina de interes și separarea acesteia de un lizat celular pentru a studia proteina.

Etichetele de fuziune pot fi polipeptide, proteine mici sau enzime adăugate la capătul amino (N) sau carboxi (C) al unei proteine. Marcarea se poate face prin clonare în vectori sau adăugată folosind editarea genei CRISPR-Cas9 pentru a marca o proteină endogenă. Utilizând o etichetă de afinitate, puteți izola sau imobiliza o proteină pentru studii proteomice suplimentare.

În timp ce cercetătorii etichetează de obicei o proteină pentru ao purifica dintr-un lizat celular și folosesc proteina izolată în teste biochimice, o etichetă peptidică poate face mai mult. De exemplu, proteinele marcate cu epitop pot fi detectate cu un anticorp specific etichetei dacă nu există anticorpi specifici proteinelor dumneavoastră. În plus, etichetele pot, de asemenea, să cuantifice proteinele, să studieze complexele proteice și să determine dacă proteina se află în interiorul sau în afara celulei. Puteți chiar vizualiza locația proteinei într-o celulă datorită etichetei proteinei.

Deci, ce etichetă proteică este potrivită pentru experimentele dvs.? Mai jos este o listă de opțiuni pentru etichetarea proteinelor cu instrumente care vă pot ajuta.

Polistidinele

Una dintre cele mai simple și mai mici etichete este eticheta de polihistidină sau eticheta 6XHis. De obicei, această etichetă peptidică este alcătuită din șase aminoacizi histidinici care pot fi plasați la capătul N sau C al unei proteine. Datorită dimensiunii reduse, eticheta His tinde să nu modifice structura unei proteine, ceea ce este util pentru testele din aval. În plus, eticheta His se poate lega de ioni metalici precum Ni 2+, Zn 2+ și Cu 2+, făcându-l util pentru purificarea sau imobilizarea proteinelor de fuziune.

Eticheta de polihistidină funcționează bine pentru a purifica rapid proteinele exprimate în E. coli, dar pentru proteinele exprimate în celule de mamifere sau insecte, numărul mai mare de reziduuri de histidină înseamnă că există o legare mai mare de fond. Prin urmare, pentru a crește puritatea proteinelor, rășinile metalice care leagă proteinele marcate cu His trebuie spălate cu strictețe. În plus, agenți de denaturare precum 8M uree sau 6M guanidină HCl pot fi utilizați cu membrană marcată cu His sau proteine insolubile pentru a îmbunătăți purificarea.

Pentru a adăuga eticheta His la proteina dvs., clonați ORF într-un vector care poartă eticheta. În funcție de promotorul utilizat, exprimați proteina marcată în celule bacteriene, de mamifere sau de insecte. Alternativ, puteți utiliza sisteme de expresie fără celule pentru exprimarea proteinelor. Pentru a purifica proteina, puteți utiliza margele magnetice (de exemplu, MagneHis ™ Protein Purification System) sau rășini nemagnetice (de exemplu, HisLink ™ Protein Purification System) pentru lizatele celulare. Dacă proteina dvs. marcată cu His este exprimată într-un sistem pe bază de lizat de reticulocit de iepure, sistemul MagZ ™ Protein Purification System este util pentru purificarea proteinelor cu hemoglobină minimă. Odată eluată din matricea de purificare, proteina dvs. marcată este gata de utilizare pentru investigații ulterioare.

Purificarea proteinelor marcate cu polihistidină

Glutation-S-transferaza

Glutation-S-Transferaza (GST) este o etichetă de afinitate utilizată pentru proteinele exprimate în E. coli pentru a purifica proteinele marcate din lizatele bacteriene. Această etichetă peptidică de 26 kDa face parte dintr-o familie de proteine cistolice prezente în eucariote, făcându-l mai puțin util atunci când se încearcă izolarea proteinelor din celulele eucariote din cauza concurenței față de alte proteine. Marcarea proteinelor eucariote cu GST îmbunătățește solubilitatea proteinelor de fuziune atunci când este exprimată în bacterii. În plus, proteinele marcate cu GST pot fi exprimate la niveluri ridicate în bacterii, dar pot forma corpuri de incluziune datorită agregării proteinelor. Eticheta GST poate fi adăugată la capătul N sau C al proteinei de interes.

GST are o puternică afinitate pentru glutation, ceea ce înseamnă că puteți capta fuziuni de proteine GST pe o matrice imobilizată, cum ar fi mărgele acoperite cu glutation. Această caracteristică de legare este utilizată pentru purificarea proteinelor, precum și pentru captarea proteinelor care s-ar putea lega de proteina dvs. (de exemplu, teste pull-down).

În timp ce proteinele cu o etichetă GST pot fi foarte exprimate și mai solubile, dimensiunea mare a etichetei poate interfera cu funcția proteinelor în aplicațiile din aval. Este posibil să vă puteți scăpa proteinele din eticheta GST, reducând posibilele interferențe funcționale. Dacă proteina exprimată s-a agregat într-un corp de incluziune, purificarea afinității folosind glutation devine problematică. GST trebuie să fie pliat corect pentru legarea cu succes la glutation și chiar dacă eticheta GST se reîntoarce, proteina dvs. de interes poate să nu fie.

Pentru a utiliza eticheta GST, începeți prin clonarea regiunii de codificare a proteinei de interes într-un vector și exprimați proteina marcată în E coli. Utilizarea unui promotor inductibil pentru a controla expresia țintă a proteinelor poate ajuta cu proteinele care sunt toxice pentru celulele bacteriene. Odată ce celulele bacteriene sunt lizate (de exemplu, utilizând reactivul de liză celulară FastBreak ™), puteți purifica proteina etichetată GST folosind o rășină pe bază de glutation (de exemplu, sistemul de purificare a proteinelor MagneGST ™). În funcție de vectorul de clonare utilizat, poate exista un loc de scindare pentru o protează pentru a elimina eticheta GST din proteină. Odată ce proteina dvs. este eluată sau scindată, aceasta este gata pentru analiză.

Fuziuni purificatoare de proteine GST

Proteina HaloTag®

În timp ce etichetele GST și 6XHis sunt utile pentru izolarea proteinelor exprimate în celulele bacteriene, există opțiuni de etichetare care sunt compatibile atât cu celulele E. coli, cât și cu celulele de mamifere. Proteina HaloTag® de 34kDa oferă această flexibilitate a sistemului de expresie. Spre deosebire de alte etichete care utilizează interacțiuni noncovalente pentru purificarea proteinelor, baza tehnologiei HaloTag® este legarea covalentă între proteina HaloTag® și ligandul acesteia. Datorită rezistenței legăturii covalente, vă puteți spăla proteina etichetată în condiții stricte și, practic, elimina orice fond de proteină nespecific. Îți faci griji cu privire la dimensiunea etichetei care afectează funcția proteinelor tale? Nici o problema! Folosiți doar proteaza TEV pentru a vă scinda proteina de HaloTag, iar proteina purificată, nemarcată, este gata de utilizare în analiza din aval.

Una dintre provocările exprimării proteinelor în celulele bacteriene este solubilitatea. Proteinele eucarotice nu sunt metilate și nu au alte modificări post-translaționale atunci când sunt sintetizate în E. coli, făcându-le predispuse la formarea corpurilor de incluziune. Etichetele de fuziune precum cea a proteinei HaloTag® pot face proteinele recombinante mai solubile și chiar pot îmbunătăți expresia în bacterii, făcând proteina de interes mai ușor de purificat. Prin exprimarea fuziunii dvs. HaloTag-proteină în celule de mamifere, vor fi prezente modificări post-translaționale, reflectând mai atent modul în care proteina va funcționa în condiții celulare. Folosind o matrice imobilizată, cum ar fi rășina acoperită cu ligand HaloTag®, puteți purifica numai proteinele cu HaloTag prezent sau utilizați în teste pull-down pentru a descoperi ce proteine sau proteine se leagă de proteina dvs. de interes. În acest fel, puteți înțelege mai bine interacțiunile proteice.

Dar aplicațiile nu se opresc cu proteinele: interacțiunile proteice și purificarea proteinelor. Dacă doriți să explorați ce secvență de ADN se leagă proteina dvs., tehnologia HaloTag® vă poate ajuta la descifrarea proteinei: interacțiunea ADN. Ce să folosim imunochimia? Avem un anticorp pentru asta. Vă interesează imagistica celulară? Cu proteina ta fuzionată cu proteina HaloTag® și liganzii fluorescenți HaloTag®, poți găsi unde este localizată proteina ta, dacă este traficată și cât de repede se răstoarnă. Există chiar liganzi pentru microscopie cu rezoluție superioară și FACS. Aflați mai multe despre tehnologia HaloTag® aici.

Pentru a începe cu tehnologia HaloTag®, clonați regiunea de codificare a proteinei dvs. de interes în vectorii de clonare tradiționali sau Flexi® pentru a adăuga HaloTag la capătul N sau C. Alternativ, puteți căuta oricare dintre mii de clone HaloTag® predefinite disponibile de la Kazusa. Odată ce aveți clona, o puteți folosi pentru orice aplicație de analiză a proteinelor. În funcție de ceea ce doriți să faceți în continuare, este posibil să aveți nevoie de un sistem de purificare (de exemplu, HaloTag® Mammalian Protein Purification System sau HaloTag® Protein Purification System) sau de o analiză pull-down (de exemplu, HaloTag® Mammalian Pull-Down Systems). Pentru studii de imagistică, va trebui să alegeți ligandul fluorescent potrivit (de exemplu, liganzii HaloTag® sau liganzii Janelia Fluor® HaloTag®). Dacă sunteți interesat de studii imunologice, Anti-HaloTag® pAb vă va ajuta. Pentru interacțiunile cu proteinele, există sistemele NanoBRET ™ PPI pentru proteine: studii de interacțiune cu proteinele și sistemul HaloCHIP ™ pentru examinarea interacțiunilor proteine: ADN.

Tehnologie de etichetare interschimbabilă HaloTag®

Figura 1. Această ilustrație arată cum proteina HaloTag® este fuzionată cu o proteină de interes și legarea covalentă între HaloTag și ligandul său.

În timp ce majoritatea etichetelor peptidice discutate anterior sunt etichete de afinitate pentru a fi utilizate în purificarea proteinelor, teste pull-down sau metode care leagă proteina marcată de o matrice solidă, există alte tipuri de etichete pentru diferite aplicații. De la cuantificarea proteinelor la marcarea endogenă, o etichetă bioluminiscentă sau chiar o mică proteină reporter fuzionată cu o proteină poate fi utilizată pentru a urmări o proteină marcată în celulă, eliminând necesitatea anticorpilor.

HiBiT

Mai mic este mai bun pentru multe lucruri și o etichetă minusculă de peptide de 11 aminoacizi numită HiBiT este excelentă pentru etichetarea unei proteine. Dacă doriți să omiteți clonarea tradițională, puteți utiliza chiar editarea genei CRISPR pentru a adăuga eticheta HiBiT la o proteină endogenă. Acest lucru are avantajul de a studia o proteină fără supraexpresie observată de obicei atunci când se utilizează expresia exogenă dintr-o plasmidă. Păstrând proteinele celulare în aceleași proporții găsite în celulă, puteți studia modificările proteinei marcate în condiții fiziologice. Acest avantaj înseamnă mai puține artefacte din supraexprimarea proteinelor și rezultate mai relevante din punct de vedere biologic. Protocolul CRISPR pentru adăugarea etichetei peptidice este simplu și de dimensiuni reduse dacă HiBiT oferă o eficiență ridicată a editării.

Singur, HiBiT nu este bioluminiscent. Cu toate acestea, odată ce se adaugă un reactiv de detecție care conține proteina LgBiT complementară, se produce un semnal luminescent luminos. Semnalul cuantificabil este ușor de măsurat folosind un luminometru. Testele bioluminescente sunt sensibile și oferă detectare până la niveluri nanomolare. Doriți să examinați proteinele extracelulare sau secretate? Avem un sistem de reactivi pentru asta! Combinați cantitatea totală de proteine marcate cu sistemul nostru litic și examinați nivelurile de proteine secretate folosind sistemul nostru extracelular. Puteți chiar elimina necesitatea unui anticorp și utilizați sistemul nostru de blot bioluminiscent pentru a detecta proteinele șterse pe o membrană. Dacă LgBiT este exprimat intracelular, puteți detecta cinetic abundența de proteine etichetate HiBiT în celulele vii. Vedeți cum puteți utiliza HiBiT pentru etichetarea proteinelor aici.

Pentru a începe să utilizați HiBiT, vă puteți clona ORF-ul într-unul dintre vectorii tradiționali MCS sau Flexi® sau puteți utiliza o metodă CRISPR pentru a adăuga eticheta la secvența genomică. Plasați eticheta acolo unde este necesar pentru o detecție optimă. Odată ce proteina dvs. este etichetată cu HiBiT, determinați ce metodă funcționează cel mai bine pentru studiile dvs. (Nano-Glo® HiBiT Lytic, Intracellular sau Blotting Systems).

Prezentare generală a sistemului de detecție litică Nano-Glo® HiBiT

NanoLuc® Luciferase

Uneori, doar un reporter va face asta. Din fericire, NanoLuc® luciferaza este o enzimă de 19 kDa, ceea ce face ca proteina bioluminiscentă să fie suficient de mică pentru a prinde o plimbare cu o altă proteină fără a interfera cu funcțiile celulare normale. Similar cu HiBiT, NanoLuc oferă o etichetă sensibilă, cuantificabilă ușor de fuziune a proteinelor. Cu toate acestea, enzima reporter nu necesită un partener de completare, simplificând utilizarea acesteia în unele aplicații. Luminozitatea și dimensiunile reduse înseamnă că luciferaza NanoLuc® se poate încadra în particule virale fără a provoca dificultăți. Citiți cum au făcut-o acești cercetători în virologie. În calitate de enzimă reporter, luciferaza NanoLuc® poate ajuta la detectarea localizării celulare a unei proteine de fuziune, precum și la urmărirea căii pe care proteina dumneavoastră o poate lua. În plus, proteinele de fuziune NanoLuc® pot fi utilizate în aplicații bazate pe transferul de energie prin rezonanță de bioluminiscență (BRET) pentru studierea interacțiunilor proteine: proteine sau implicarea țintă a moleculelor mici. Aflați mai multe despre capacitățile acestei enzime reporter.

Pentru a crea o fuziune de proteine cu luciferaza NanoLuc®, va trebui să vă clonați ORF într-un vector reporter NanoLuc®, plasând NanoLuc pe capătul N sau C. În funcție de aplicație, puteți utiliza un sistem de detecție litică (de exemplu, Nano-Glo® Luciferase Assay System) sau un test de detectare a celulelor vii (de exemplu, Nano-Glo® Live Cell Assay System).

rezumat

Alegerea unei etichete pentru proteina dvs. se bazează pe nevoile dvs. experimentale. Indiferent dacă aveți nevoie de o etichetă de afinitate pentru purificarea proteinelor, doriți să creați o singură proteină de fuziune pentru a fi utilizată într-o varietate de metode de analiză a proteinelor sau adăugați o etichetă endogenă folosind editarea genei CRISPR-Cas9, există o serie de etichete și enzime reporter disponibile.