Fenotiparea cardiacă a șoarecilor deficienți TASK-1 și Pannexin-1 - PDF gratuit
Fenotipare cardiacă a șoarecilor deficienți TASK-1 și pannexin-1 DISERTARE INAUGURALĂ pentru obținerea diplomei de Dr.med.vet la Departamentul de Medicină Veterinară de la Universitatea Justus Liebig Giessen Stella Schulte (născută Petrić)
Trimis de Institutul de Farmacologie și Toxicologie al Universității Justus Liebig Gießen Supervizor: Prof. Dr. Joachim Geyer și de la Clinica de Cardiologie și Pneumologie Pediatrică de la Clinica Universitară Düsseldorf Supervizor: Prof. Dr. Birgit Donner Fenotiparea cardiacă a șoarecilor deficienți TASK-1 și pannexin-1 DISERTARE INAUGURALĂ pentru obținerea diplomei de Dr.med.vet la Departamentul de Medicină Veterinară de la Universitatea Justus Liebig din Giessen prezentată de medicul veterinar Stella Schulte (născută Petrić) din Freiburg Gießen 2016
Cu aprobarea Departamentului de Medicină Veterinară a Universității Justus Liebig Decan Gießen Prof. Dr. Dr. Martin Kramer Recenzor Prof. Dr. Joachim Geyer Prof. Dr. Ziua disputei Birgit Donner 10 mai 2017
Unda de introducere intersectează linia izoelectrică (Mitchell și colab., 1998; Chaves și colab., 2003; Swynghedauw și Aubert, 2003; vezi Figura 1.6). R R R R P S Q R R R R Capătul undei T (sfârșitul repolarizării) P S Figura 1.6: Definiția manuală a capătului undei T cu mouse-ul. Modificat din Mitchell și colab., 1998 Intersecția undei T și a liniei izoelectrice este definită ca fiind sfârșitul repolarizării. Q Ritmul cardiac de repaus fiziologic al șoarecelui este de aproximativ 550-620 bătăi pe minut (min -1; Takuma și colab., 2001; Kass și colab., 1998), care este semnificativ mai mare decât cel al oamenilor cu o medie de 70 bătăi pe minut (Doevendans și colab.) al., 1998; Silbernagel și Despopoulos, 2003). Intervalele PR, RR, QRS și QT sunt corespunzător mai scurte la șoareci. Pe scurt, se poate spune că potențialele de acțiune și structura anatomică a inimii, precum și expresia canalului ionic ale celor două specii, diferă marginal una de cealaltă, dar totuși permit în mod esențial transferul rezultatelor cercetării de la șoarece la om. Conform stării actuale a cunoașterii, este cu siguranță cel mai bun dintre toate sistemele posibile pentru cercetarea de bază din inimă. 9
Introducere 1.5.3 Utilizarea, dezvoltarea și posibilitățile șoarecilor knock-out Munca preliminară pentru dezvoltarea șoarecilor knock-out i-a adus pe americanul Mario Capecchi și pe cei doi colegi ai săi de cercetare britanici Sir Martin Evans și Oliver Smithies în 2007 Premiul Nobel pentru medicină. Până în prezent, șoarecii knock-out sunt singurele creaturi create în laborator folosind tehnici transgenice în care una sau mai multe gene au fost oprite cu succes și în mod specific. Acestea își pierd funcția și permit cercetătorilor să tragă concluzii despre rolul lor în bolile (ereditare). Cu cele două linii de reproducere, șoarecii pannexin-1 și TASK-1, avem astfel de șoareci knock-out disponibili pentru experimente. Cu toate acestea, rămâne întotdeauna întrebarea finală cu privire la transferabilitatea rezultatelor la oameni. 10
Introducere 1.5.4 Producerea șoarecilor knock-out 1. Cultura celulară (celule stem embrionare, ES) Figura 1.7: Producția șoarecilor knock-out Modificat conform Graw, 2007 Un vector țintă este transfectat într-o cultură celulară de celule stem embrionare și recombinare omoloagă încorporate în ADN-ul celulelor stem. Ca urmare a proliferării celulelor modificate, se creează în cele din urmă o populație de celule cu o genă modificată, care este injectată în blastocisti de șoarece. Acești blastocisti sunt introduși în șoareci femele prin transfer embrionar și transportați de ei. Șoarecii născuți fie poartă material genetic exclusiv normal (de tip sălbatic), fie, așa-numiții șoareci mozaici, jumătate sunt de tip sălbatic și jumătate sunt modificați genetic. Acestea din urmă sunt heterozigoți. Încrucișările cu șoareci heterozigoți duc în cele din urmă la șoareci homozigoti knock-out. 11
Introducere ES2-247 ES1-84 CE-395 CE-494 IS-169 CE-379 IS = Buclă intracelulară; ES = bucla extracelulară; CE = capăt carboxi terminal (numerele de după fiecare arată pozițiile aminoacizilor din domeniile transmembranare) Figura 1.9: Comparație structurală a celor trei gene de pannexină diferite ale șoarecelui Modificat conform Penuela și colab. precum și 2 bucle extracelulare și un capăt intracelular carboxi și amino terminal. Capătul terminal carboxi al pannexin-2 este mult mai lung decât cel al celorlalte două pannexine. 1.6.2 Expresia și funcția pannexin-1 Pannexin-1 este singura dintre cele trei proteine pannexin care pot fi detectate omniprezent (Barbe și colab., 2006); expresia sa este deosebit de puternică în eritrocite, celule endoteliale și astrocite, unde sunt eliberate din ATP sunt implicați (Wang și colab., 2007). Expresia sa în inima șoarecelui (Ray și colab., 2005; Nishida și colab., 2008) este crescută prin presiune (Nishida și colab., 2008). În plus față de inima șoarecelui, pannexin-1 ar putea fi detectată și în sarcolema cardiomiocitelor câinilor (Dolmatova și colab., 2012). 15
Introducere Pe lângă perioadele de tranziție și perioadele refractare, lucrarea de față își propune, de asemenea, să analizeze vulnerabilitățile șoarecilor TASK-1 +/+ și TASK-1 -/- in vivo folosind catetere octapolare programate într-un studiu electrofiziologic (EPU), poate fi determinată stimularea intracardică. 25
Material și metode 2 Material și metode 2.1 Genotiparea șoarecilor Pannexin-1 și TASK-1 WT și KO 2.1.1 Pregătirea ADN-ului din vârfurile cozii Prepararea ADN-ului folosind trusa DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden) a fost efectuată de la aproximativ Vârfuri de coadă dezosate lungi de 3 mm, care au fost scoase de la șoareci atunci când au fost înțărcate în același timp cu marcarea urechii. Eșantion de țesut Dizolvarea pereților celulari Legarea procesului de spălare a ADN-ului Figura 2.1: Principiul preparării ADN-ului modificat conform manualului din trusa DNeasy Blood and Tissue În timpul primului pas, proteinaza K dizolvă pereții celulari și astfel eliberează ADN-ul lor. Diverse tampoane permit apoi legarea optimă a ADN-ului la membrana DNEasy în tuburile special furnizate. Două procese de spălare conduc în cele din urmă la îndepărtarea materialului neutilizabil și a inhibitorilor enzimatici și a ADN-ului pur care trebuie eluat gata de utilizare. Eluție Puritatea ADN-ului gata de utilizare și concentrația ADN-ului au fost determinate fotometric (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, SUA). 26
Material și metode pachet vizibil al excitației Sale. De regulă, a fost văzut cel mai clar în înregistrări în care amplitudinea excitației atriale a fost aproape la fel de mare ca cea a ventriculului. Atriul său de excitație a fasciculului (A) A Începutul său: semnalul atriului V începutul: stimularea ventriculară (V) Figura 2.6: Măsurarea fasciculului său într-un mouse pannexin 1 +/+. Detectarea (înregistrarea semnalului) cu e3e4 Pachetul lui His ar putea fi recunoscut cel mai bine atunci când amplitudinile excitației atriale și ventriculare au fost la fel de mari în înregistrarea intracardică. Dacă s-a găsit un pachet de excitație, s-au înregistrat șase bătăi de inimă succesive pentru fiecare șoarece în ceea ce privește AH (începutul stimulării atriale până la pachetul His), HV (pachet de His până la începutul stimulării ventriculare) și intervalul AV (începutul atrialului până la Începutul excitației camerei). Am efectuat acest lucru pe șase șoareci pannexin-1 și cinci șoareci TASK-1 din ambele genotipuri. Valorile medii per animal au fost evaluate statistic. 38
Material și metode 2.8 Examinări telemetrice la șoareci pannexin-1 +/+ și pannexin-1 -/- 2.8.1 Noțiuni de bază La șoareci, ECG-urile pe termen lung pot fi înregistrate numai folosind emițătoare plasate subcutanat sau intraperitoneal. Acestea sunt o modalitate bună de a obține ritmul cardiac de repaus dificil de menținut la șoareci fără influența narcoticelor (Bernstein, 2003; Berul 2003). Semnalele EKG sunt înregistrate de doi electrozi, trecuți pe plăcile receptoare, filtrate de o matrice (ambele DSI Data Sciences, Minneapolis, SUA) și în cele din urmă vizibilizate de programul de computer (LabChart 7). Figura 2.8: Transmițătoarele noastre de telemetrie Transmițătoarele implantate subcutanat de noi (modelul ETA-F10 de la DSI). 1 Șoareci pannexin-1 masculin și feminin WT și șoareci knockout cu vârsta cuprinsă între 3-6 luni și cântărind cel puțin 23 g au fost folosiți pentru implantarea subcutanată a transmițătorului de aproximativ 1,6 g (DSI Data Sciences, Minneapolis, SUA) folosit. Ca de obicei la rozătoare, toate animalele au avut acces gratuit la alimente și apă până când a fost indusă anestezia. 1 http://www.datasci.com/products/implantable-telemetry/mouse-(miniature)/eta-f10 43
Material și metode 2.8.2 Pregătiri pentru implantarea transmițătorului De îndată ce animalele au atins stadiul toleranței la anestezie după injectarea intraperitoneală de ketamină și xilazină, le-am fixat în poziție culcat pe o placă de încălzire (HAT 007, Minitüb GmbH, Tiefenbach). Membrele dvs. au fost atașate de acestea din urmă cu benzi adezive, în timp ce noi am tratat ochii cu unguente pentru ochi disponibile în comerț (de exemplu, HYLO -Gel, Ursapharm, Saarbrücken) pentru a proteja împotriva deshidratării. Animalele testate au fost furnizate cu 0,5 l/min oxigen (Linde AG, Pullach) și 1,5% vol isofluran (Isofluran Actavis, Actavis, München) printr-o mască de gaz din latex. Se aflau pe un dispozitiv de aspirație Plexiglas care fusese special realizat în acest scop și care trebuia să împiedice evadarea aerului care conține izofluran. Figura 2.9: Mouse pe masa de operație Un mouse pe dispozitivul de aspirație Plexiglas și pe covorul de încălzire. Piesa albastră de latex a servit drept mască de gaz. În timpul acestor preparate, transmițătorul steril și o seringă mixtă de 1 ml din glucoză 5% și soluție salină fiziologică au fost preîncălzite într-o baie de apă. 44
Material și metode La sfârșitul investigațiilor, șoarecii au fost uciși, transmițătoarele de telemetrie au fost îndepărtate, curățate și dezinfectate utilizând soluțiile Gigazyme și Gigasept (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt). 2.8.5 Înregistrarea ECG-urilor pe termen lung Analog cu Kramer și colab. (1998) am început să înregistrăm ECG-urile de 24 de ore după zece zile de la implantarea transmițătorului. Pentru a nu provoca iritații sau modificări de comportament, animalele au rămas în cuști individuale în timpul înregistrării. În zilele înregistrării ECG, s-a avut grijă să se evite expunerea neobișnuită la oameni și zgomotele din camera animalelor, astfel încât ritmul invers zi-noapte să nu fie perturbat. Toate dispozitivele necesare pentru înregistrarea ECG, cum ar fi laboratorul de alimentare, computerul, monitorul, plăcile de înregistrare, cutia și diverse cabluri de alimentare au fost dezinfectate temeinic înainte de a fi aduse în camera animalelor respective (Incidin Liquid, Ecolab, Monheim). Datele au fost înregistrate cu software-ul LabChart 7 (ADInstruments, Spechbach) și o rată de eșantionare de 1 kHz. PC cu software de analiză Receptor Transmitter Input-Matrix Figura 2.11: Reprezentarea schematică a înregistrării ECG pe termen lung Modificat din Kramer, 2000 47
Material și metode 2.8.7.1 Experimentele de înot înot (SV) sunt considerate în medicina experimentală animală ca mișcare cu efort constant, ceea ce duce la efort submaximal (Bernstein și colab., 2003). După înregistrarea telemetrică a unui ECG în repaus timp de cinci minute, animalele au înotat individual timp de încă cinci minute într-o cușcă Makrolon de dimensiunea II (15 cm înălțime umplută cu apă caldă de la robinet 37-39 C). Dacă animalele individuale au fost scufundate din cauza epuizării, acestea au fost sprijinite pe scurt manual. EKG a fost înregistrat în timpul înotului și în timpul perioadei de 10 minute post-exercițiu în care șoarecii s-au întors în cuștile lor. Figura 2.12: Șoricel în timp ce înotați cu suport manual Pentru evaluare, am împărțit încercarea de înot în trei faze după cum urmează: Tabelul 1: Momentul încercării de înot Faza Durată (min) Activitate 1 0 până la 5 Odihnă 2 5 până la 10 Înot 3 10 până la 20 Recuperare 2.8.7.2 Exercițiu cu bandă de rulare Exercițiu Exercitarea oboselii fizice prin intermediul treadmill-ului este considerat standardul de aur pentru a menține stresul cardiovascular controlat la om sau la alte mamifere mari 49
Material și metode Mențineți viteza de mers cu sau fără înclinare și terminați când animalele sunt epuizate (Desai și colab., 1999; Kemi și colab., 2002; Massett și Berk, 2005; Niebauer și colab., 1999). Primul nostru protocol I de bandă de alergat fără înclinare (vezi Tab. 2) a fost limitat la un traseu de alergare drept, timp în care viteza a crescut constant până la oboseala. Tabelul 2: Protocolul I al benzii de rulare fără înclinare Timp (min) Al doilea protocol II al benzii de rulare II cu înclinația a fost efectuat cel mai devreme la 2 zile după primul, pentru a permite animalelor un timp de regenerare. În plus față de creșterea constantă a vitezei, înclinațiile în 5 trepte de la 0 la 25 au fost introduse la fiecare patru minute (vezi Tabelul 3). Viteză (m/min) Timp (min) Viteză (m/min) 0 2 20 13 2 3 22 14 4 5 24 15 6 6 26 16 8 7 28 17 10 8 30 18 12 9 32 19 14 10 34 20 16 11 36 21 18 12 38 22 Tabelul 3: Protocolul benzii de rulare II cu înclinare Timp (min) Viteză (m/min) Setare rampă (grade) Timp (min) Viteză (m/min) Setare rampă (grade) 0 2 0 16 10,2 20 2 3 "18 11,4" 4 3,3 5 20 12,5 25 6 4,5 "22 13,7" 8 5,6 10 24 14,8 "10 6,8" 26 15,9 "12 7, 9 15 28 16,5 "14 9,1" 30 17,7 "51
MATERIAL ȘI METODE Imediat după debutul epuizării, animalele au fost readuse în cuști și ECG-ul lor a fost înregistrat în timpul fazei de recuperare de 10 minute. Distanța parcursă și viteza în momentul oboselii au fost înregistrate pentru fiecare șoarece. Faza de recuperare a avut loc întotdeauna sub observație și s-au observat orice anomalii. Figura 2.14: Un mouse pe banda rulantă dreaptă Dacă ambele protocoale ale benzii de rulare și fazele de recuperare asociate s-au încheiat, animalele au fost ucise prin dislocare cervicală. Au fost apoi folosite pentru a determina parametrii corpului. Ca și în cazul testului de înot, testele benzii de alergare au fost împărțite în trei secțiuni diferite pentru evaluare: Tabelul 4: Sincronizarea ambelor teste ale benzii de rulare Faza Durată (min) Activitate 1 0 până la 5 Odihnă 2 5 până la 10 Banda de alergare 3 10 la 20 Recuperare 52
Material și metode Datorită frecvențelor de cadru ridicate și rezoluției spațiale bune, acum sunt posibile și examinări ecocardiografice pe inima mică a șoarecelui cu ritmul cardiac ridicat. Ecocardiografia a fost efectuată cu Vevo 2100 (FUJIFILM Visual Sonics Inc., Toronto, Canada) și un traductor liniar MS 400 cu 18-38 MHz. Au fost mediate 10 bătăi de inimă pentru fiecare valoare de măsurare la 14 șoareci cu deficit de pannexin-1 +/+ și 12 pannexin-1. Figura 2.15: Dispozitivul cu ultrasunete pe care l-am folosit 2 Toți șoarecii au fost examinați prin ecocardiografie nu mai devreme de douăsprezece zile de la implantarea transmițătorului. 2.9.2 Efectuarea ecocardiografiei Inducerea anesteziei a fost efectuată cu 5% izofluran (Isofluran Actavis, Actavis, München) și 0,5 l/min oxigen (Linde AG, Pullach) și a fost redus la 1,5% izofluran cu debitul de oxigen rămânând constant Pentru a menține cât mai redusă influența gazului anestezic asupra sistemului cardiovascular. Animalele trebuie să fie imobile. Pentru examinare, șoarecii au fost așezați pe spate pe placa încălzită a sistemului Vevo, care a fost preîncălzită la temperatura corpului, care a servit și ca masă mobilă, 2 www.visualsonics.com/vevo2100 54
Material și metode stabilite. În acest scop, labele ei au fost fixate cu benzi adezive pe senzori pentru înregistrarea EKG, capul i-a fost plasat în masca de gaz și temperatura corpului a fost monitorizată folosind un senzor rectal. Pentru a menține imaginile cu ultrasunete cât mai libere de artefacte, ne-am ras șoarecii în zona pieptului (Contura, Wella, Darmstadt). Figura 2.16: Șoricel în timpul ecocardiografiei Animalul testat se află pe o masă de încălzire în timpul ecocardiografiei și primește gaz anestezic (izofluran) printr-o mască. În scopuri de monitorizare, membrele sale sunt atașate la senzorii EKG cu bandă adezivă și un senzor rectal (albastru) înregistrează temperatura corpului. Pentru o imagine de ansamblu mai bună, am ales ca primă imagine axa lungă parasternală. În această setare, au fost înregistrate debitul aortic, diametrul inelului valvei aortice, lungimea inimii și un mod M pentru măsurarea grosimii peretelui. 55
Material și metode Figura 2.17: Măsurarea lungimii diastolice a inimii și a circumferinței interioare a inimii în axa lungă parasternală Verde: Încercarea manuală a endocardului și măsurarea lungimii inimii în diastolă În plus, am folosit această setare pentru a calcula masa inimii ventriculare stângi conform metodei suprafeței-lungime, ceea ce duce la cele mai bune rezultate la oameni și șoareci (Collins și colab., 2001; Devereux și colab., 1986). Lungimea ventriculului stâng este măsurată de la vârful endocardic până la inelul mitral și se produce un mod M la nivelul mușchiului papilar (Collins și colab., 2001). Cu următoarea a doua setare, axa scurtă, am salvat 3 planuri diferite de tăiere în modul B în zone ale vârfului, centrului și bazei. Pentru a face acest lucru, endocardul a fost încercuit manual în toate cele trei planuri de tăiere din sistolă și diastolă. Figura 2.18: Axa scurtă în modul B (ventriculul stâng) Negru în mijloc = lumenul inimii, în jurul său gri deschis = endocard, gri închis = miocard 56 Ventricul drept
Material și metode 2.11 Evaluări statistice Datele tuturor experimentelor sunt prezentate ca valori medii (MW) ± deviație standard (SD) și provin dintr-un număr de șoareci (n) explicate în fiecare experiment. În funcție de ceea ce a fost adecvat pentru întrebare, semnificația statistică a fost calculată cu testul t nepereche, cu ANOVA unidirecțională sau cu regresia liniară. Cu o valoare p de