Identificarea și caracterizarea variantelor ATP13A2 și relevanța acestora pentru

Identificarea și caracterizarea variantelor ATP13A2 și semnificația acestora pentru bolile neurodegenerative Disertație inaugurală pentru obținerea titlului de doctor al Facultății de Matematică și Științe Naturale a Universității din Köln prezentată de André Heimbach de la Essen Köln 2009

caracterizarea

Prezenta disertație a fost publicată cu aprobarea Facultății de Matematică și Științe Naturale a Universității din Köln la Institutul de Genetică Umană (Director: Prof. Dr. Brunhilde Wirth) al Universității din Köln sub conducerea Prof. Dr. Thorsten Hoppe și prof. Dr. Christian Kubisch a făcut. Recenzent: Prof. Dr. Thorsten Hoppe Prof. Dr. Christian Kubisch Ziua ultimei examinări orale: 12 ianuarie 2010

Cuprins Cuprins Cuprins Lista prescurtărilor 1 Introducere 1 1.1 Boli neurodegenerative 1 1.1.1 Parkinsonism 1 1.1.2 Sindromul Kufor-Rakeb și ATP13A2 5 1.2 ATPaze tip P 6 1.2.1 Transportul substanțelor prin membrane biologice 6 1.2.2 Pompele alimentate cu ATP 6 1.2.3 Structura ATPazelor de tip P 7 1.2.4 Mecanismul funcțional al ATPazelor de tip P 8 1.2.5 Clasificarea ATPazelor de tip P 10 1.2.5.1 ATPazelor de tip I 11 1.2.5.2 ATPazelor de tip II 11 1.2.5.3 ATPazelor de tip 11 11 1.2. 5.4 ATPaze de tip IV 12 1.2.5.5 ATPaze de tip V 12 1.2.6 Mutații în ATPaze ca cauză a bolilor 13 1.3 Obiectivele activității 15 2 Materiale și metode 16 2.1 Produse chimice 16 2.2 Consumabile 16 2.3 Soluții generale 16 2.4 Enzime 17 2.5 Sisteme de reactivi comerciali ( Kituri) 17 2.6 Deoxiribonucleotid trifosfați (dntp) 17 2.7 Vectorii de clonare 18 2.8 Dispozitive utilizate 18 2.9 Baze de date și alte site-uri web 19 2.10 Software 20 2.11 Metode biologice moleculare 20 2.11.1 Reacția în lanț a polimerazei (PCR) 20 2.11.2 Proiectarea grundului 20 2.11.3 Loturi de reacții PCR 21 I

Lista abrevierilor Lista abrevierilor A absorbție A adenină AA aminoacid A. apă distilată Fig. Figura AK anticorp ABI Applied Biosystems AP fosfatază alcalină ATP adenozin trifosfat BAC cromozom artificial bacterian BCA acid bicinchoninic (acid bicinchoninic; 2,2-chinolin-4,4-dicarboxilic) perechi de baze bp BSA albumine serice bovine (albumine serice bovine) C citozină cdna ADN copie a unui ARN comp-het compus-heterozigot DAPI 4 6-diamidino-2-fenilidol ddntp dideoxinucleotid trifosfat Eliminare DMEM Dubecco s Modificat Eagle s Mediu DMSO dimetil sulfoxid 5 trifosfat dpc zile după coitum DTT Dethiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Acid etilendiaminetetraacetic EF celule alimentatoare embrionare (murin) ER reticul endoplasmatic ES celule stem embrionare (murin) F primer primer (primer în direcție înainte) F din F c FKS G. G antigen Fragment dintr-o proporție constantă de anticorp dintr-un anticorp f etal vițel ser guanină grame V

Lista abrevierilor h oră HCl acid clorhidric HEK rinichi embrionar uman (celule hepatice embrionare umane) het heterozigot homozigot HRP peroxidază de hrean (hrean peroxidază) H 2 O apă Imunoglobulină IgG din grupa G Imunoglobulină IgM din grupa M IHF integrare factor gazdă J Joule k kilo kb perechi kilobazei kda kilodaltoni KO knock out KRS Sindrom Kufor-Rakeb l litru LAMP proteină de membrană asociată lizozomului LB Luria Bertani m milli (factor 10-3) M molar ma milli-ampere Mb megabase perechi min minute MMC micomicină C MOPS 3-N-morfolino-propanesulfonic acid MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridină MTT 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromură n nano (factor 10-9) N soluție salină normală NADH nicotinamidă adenină dinucleotidă NADPH nicotinamidă adenină dinucleotid fosfat NaOH soluție de hidroxid de sodiu Neo neomicină OD n densitate optică (absorbanță la o lungime de undă de n nanometri) p pico (factor 10-12) VI

Lista abrevierilor PAA PAGE PCR PD PDI ph PIC R rh RNase rpm RT SDS sec T TAE Taq TE TM U UPS UV V WT w/v poliacrilamidă poliacrilamidă gel electroforeză polimerază reacție în lanț Boala Parkinson (boala Parkinson) proteină disulfură izomerază logaritm negativ negativ al concentrației ionilor de hidrogen proteaze -Inhibitor primer invers cocktail (primer în direcție inversă) umiditate relativă (umiditate relativă) rotații ribonucleaze pe minut (rotații pe minut) temperatura camerei sodiu dodecil sulfat secunde timină tris-acetat-EDTA Thermus aquaticus Tris-EDTA unitate de domeniu transmembranar - unitate definită a activității enzimei ubiquitin- Sistemul proteasom lumină ultravioletă volți greutate de tip sălbatic pe volum VII

Material și metode 2. Material și metode 2.1 Produse chimice Produse chimice, substanțe organice și solvenți cu desemnarea calității analiza pro au fost utilizate și obținute de la următoarele companii: Amersham (Freiburg) AppliChem (Darmstadt) BD Biosciences Clontech (Heidelberg) Calbiochem (Darmstadt) Difco Lab (Sparks/SUA) Fermentas Life Sciences (St. Leon-Rot) Fluka (Taufkirchen) GE Healthcare (München) Invitrogen (Karlsruhe) Merck (Darmstadt) New England Biolabs (Frankfurt pe Main) Perkin Elmer (Massachusetts/SUA) Pierce (Rockford/SUA) Roche (Mannheim) Sigma-Aldrich (Taufkirchen) 2.2 Consumabile Produse din plastic și vase de reacție au fost obținute de la Greiner (Frickenhausen) și Sarstedt (Nümbrecht). 2.3 Soluții generale Dacă nu se specifică altfel în protocol, apa distilată (A. dest) a fost utilizată pentru toate tampoanele, soluțiile și mediile. Tampon TE (ph 8) 10 mm Tris-HCl 1 mm EDTA și 500 ml HPLC-H 2 O, filtru steril, depozitare la -20 C tampon TE -4 (ph 8) 10 mm Tris-HCl 0,1 mm Na Filtru steril 2-EDTA, depozitare la -20 C 10 X PBS (pH 7,4) 80 g NaCl 2 g KCl 14,4 g Na 2 HPO 4 2,4 g KH 2 PO 4 autoclavă ad 1 l H 2 O, Depozitare la RT 16

Material și metode 2.7 Vectorii de clonare Tab. 2.2: Vectorii utilizați (hărți vectoriale în anexă) Nume Descriere Dimensiune [bp] Sursă pcdna 3.1 V5/Vectorul său de expresie 5523 Invitrogen pdonr221 Vectorul de clonare 4762 Invitrogen pcdna-dest53 Vectorul de expresie 7767 Invitrogen PPNT vectorul de țintire 7200 AG Zimmer pdonr221 -Vektor 7314 AG Brüning 2.8 Dispozitive utilizate Tab. 2.3: Dispozitive tehnice utilizate Model aparat Producător Autoclavă Sterilizator cu abur Varioklav H + P Tehnologie de laborator Incubator Hera Cell 150 Cameră de electroforeză Sub-Cell GT Bio-Rad X-Cell Sure Lock Dispozitiv de electroporare cu Invitrogen Gene Pulser System Biorad Capacitance Mașină de dezvoltare Extender Biorad Curix 60 Agfa Geiger contor LB 124 Berthold gel documentare sistem Chemidoc XRS Biorad încălzire/agitare placă MR 3001 Heidolph hibridizare dulap tip 30 Special Hyb Bachofer incubare agitator microscop Innova 44 Axioplan2 Zeiss dispozitiv nucleic de măsurare a acidului nucleic/proteine ​​Nano Drop ND-1000 New Brunswick S. pH-metric cientific PeqLab ph inolab ph nivel 1 Ajutor pentru pipetare WTW Cercetare Eppendorf Real-Time PCR System Easypet 7500 Real Time PCR System (Taq-Man) Eppendorf ultrapure water system Milli-Q; Q-Gard 2 Millipore Roller Shaker Roller Mixer SRT 1 Stuart Applied Biosystems 18

Materiale și metode Sequencer ABI Prism 3100 Analizator genetic Biosystems aplicate Dispozitive de tensiune Power Ease 500 Invitrogen Power Pac Banc de lucru steril Bio-Rad Hera Safe KS 12 Kendro Thermoblock Heatblock II VWR Thermocycler icycler Biorad Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems Thermomixer compact Epp IKA Benchtop Centrifuge Galaxy Mini VWR Transfer Module X-Cell II Blot Module Invitrogen Ultrasonic Bath USC 100T VWR Ultracentrifuge Avanti J 20 XPi Beckman Coulter UV Crosslinker CL-1000 UV Crosslink UVP UV Camera GS Gene Linker Camera UV Bio Rad Vortex Reax Top Heidolph Waage Acculab Vicon Sartorius balance (balance de precizie) ARJ 120-4M Kern water bath WB22 Memmert centrifuge Centrifuge 5415D Eppendorf Centrifuge 5415R Eppendorf Allegra X-22R Beckman Coulter Varifuge 3.0 RS Kendro 2.9 Baze de date și alte site-uri web BACPAC Resources Center BDGP BioTools: wwwtacg Prediction v3.0. NEP P-Type ATPases UCSC Vector Designer http://bacpac.ch ori.org/ http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html http://biotools.umassmed.edu/tacg/wwwtacg.php http://www.cbs.dtu.dk/services/ http: //www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.neb.de http://biobase.dk/

exe/patbase.html http://genome.cse.ucsc.edu/index.html https://vectordesigner.invitrogen.com/login.cfm 19