IgG - ttg - Răspuns imun la diabetul de tip 1 cu boală celiacă - PDF Descărcare gratuită
Spitalul Universitar Ulm Centrul de Medicină Internă Clinica de Medicină Internă I Director medical: Prof. Dr. Guido Adler Focus pe endocrinologie, diabet și metabolism Prof. Dr. med. Bernhard O. Böhm IgG - ttg - răspuns imun la diabetul de tip 1 cu boală celiacă Disertație pentru obținerea titlului de doctor în stomatologie la Facultatea de Medicină a Universității din Ulm prezentată de Timo Knoche Böblingen 2010 I
Decan interimar: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin Raportor 1: Prof. Dr. Bernhard Otto Böhm Reporter 2: Prof. Dr. Ziua doctoratului Peter Kern: 22 aprilie 2010 II
Cuprins Lista abrevierilor 1. Introducere 1 1.1 Definiția bolii celiace 1 1.2 Istoric 2 1.3 Epidemiologia și patogenia bolii celiace 4 1.4 Formele bolii celiace 8 1.5 Boala celiacă și alte boli 12 1.6 Probleme 16 2. Material și metode 17 2.1 Reactivi, soluții și tampoane 17 2.2 Dispozitive și consumabile 19 2.3 Sera pentru pacienți 20 2.4 Determinarea titlului 21 2.4.1 Determinarea titlului ttg-iga 21 2.4.2 Determinarea titlului ttg-igg 29 3. Rezultate 30 3.1 Determinarea titlului ttg-iga 30 3.2 Determinarea titlului ttg-igg 32 3.3 Compararea directă a titrurilor ttg-igg cu ttg-iga 34 3.4 Comparația computațională a titrurilor/rezultatele statistice 38 IV
4. Discuție 43 5. Rezumat 52 6. Bibliografie 53 Anexa V
Lista abrevierilor AGA anticorpi împotriva Gliadin APC Antigeni care prezintă celulă BSA Ser bovin albumină CD Cluster de diferențiere DR, locurile genei DQ HLA pe cromozomul 6 DZG Deutsche Zöliakie Gesellschaft e.v. ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EmA Endomysium Antibodies ESPGHAN European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition GFD Dieta fără gluten, Dieta fără gluten H 2 SO 4 Acid sulfuric HLA Leucocite umane Antigene IFN Interferoni IgA Imunoglobulină Tip A IgE Imunoglobină Imunoglobulină IgM tip G de tip M IL Interleukină MHC Histocompabilitate majoră Complex ml Mililitri Matrice MMP Metaloproteinaze mrna messenger Acid ribonucleic PBS Fosfat tamponat salin TGF Tumor Factor de creștere TMB Tetrametilbenzidină TNF Tumoră Necroză Factori Ttg Transmisie; arbitrar, arbitrar unitate VI
- Biopsia de control indicată în caz de succes clinic îndoielnic cu o dietă fără gluten - Expunerea la gluten cu biopsie indicată în: - Îndoieli cu privire la diagnosticul inițial - Diagnosticul la vârsta de 30/100 celule epiteliale) și arhitectura mucoasei normale, tip hiperplazic II, cu hiperplazie criptă, limfocite intraepiteliale crescute și vilozități normale și tipul distructiv III cu 3 subtipuri de la a la c, care arată plin sau aplatizarea vilozităților, hiperplazie de criptă, limfocite intraepiteliale crescute și infiltrat inflamator în lamina propria (DZG 2009). 11
Anticorpii Endomysium în intervalul normal și, de asemenea, biopsia Dudenal prezintă o imagine normală. Pacienții cu deficit selectiv de IgA prezintă un risc de 10 ori mai mare de a dezvolta boala celiacă. Sindromul Sjogren, căderea părului și boala Addison sunt alte tulburări care pot fi legate de boala celiacă. Riscul de limfom în intestinul subțire este cel mai mare la pacienții cărora li s-a diagnosticat boala celiacă la vârsta adultă. Cancerul faringian și esofagian poate fi găsit mai frecvent și la pacienții celiaci. Cu toate acestea, cele mai recente studii din 2004 arată că există doar un risc moderat de creștere a tumorii și că respectarea unui DGG strict duce la o ajustare a riscului la populația generală în termen de 5-10 ani (Mäki și Collin 1997, DZG 2009). 15
1.6 Problemă Odată cu introducerea diagnosticului serologic și descoperirea anticorpilor, prevalența a crescut rapid. A devenit clar că pacienții cu boală celiacă înregistrați prin biopsie erau doar vârful aisbergului. Dezavantajele testelor tisulare, testului endomisiu și testului reticulinei sunt costurile ridicate și aportul limitat de substrat care trebuie obținut de la esofagul maimuței. În plus, personalul special instruit este obligat să efectueze aceste teste, deoarece testele sunt tehnic foarte complexe. (Mäki și Collin 1997). După identificarea antigenului ttg, s-ar putea dezvolta truse de test specifice pentru detectarea cantitativă a anticorpilor. Testele precum Elisa nu numai că au facilitat diagnosticul inițial, ci și diagnosticul de urmărire și diagnosticul de control. Testele obișnuite folosesc antigenul ttg pentru a detecta anticorpii IgA și IgG. Această teză sa axat pe distribuția IgA și IgG anti-tTG-Ab în contextul diabetului de tip 1. Scopul este de a verifica dacă rezultatele permit să se tragă concluzii despre procesul imunologic și dacă acest lucru poate îmbunătăți diagnosticul. 16
2. Material și metodologie 2.1 Reactivi, soluții și tampoane Celikey IgG PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Transglutaminază tisulară (umană, recombinantă) Test de anticorp IgG pentru diagnostic in vitro Benzi de microtitrare (17996) acoperite cu antigen ttg uman recombinant 6 ttg ( IgG) soluții standard de anticorpi în concentrații 0 3 7 16 40-100 U/ml în PBS cu BSA 0,095% (g/v) azidă de sodiu 1 martor pozitiv cu BSA, 0,095% (g/v) azidă de sodiu, detergent și ser uman în PBS 1 control negativ cu BSA, 0,095% (g/v) azidă de sodiu, detergent și ser uman în concentrat tampon de spălare PBS 20x concentrat PBS cu 0,095% (g/v) azidă de sodiu și tampon de probă detergent cu BSA, 0,095% (g/v) azidă de sodiu și detergent, conjugat IgG galben colorat, peroxidază IgG anti-umană, roșu colorat Substrat enzimatic TMB (3, 3, 5, 5, tetrametilbenzidină) soluție stop, 0,5 MH 2 SO 4, incolor 17
Celikey PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Transglutaminază tisulară (umană, recombinantă) Test de anticorp IgA pentru diagnostic in vitro Benzi de microtitrare (18196) acoperite cu antigen ttg recombinant 6 ttg (IgA) anticorpi Soluții standard în concentrații 0-3 7-16-40-100 U/ml în PBS cu BSA 0,095% (g/v) azidă de sodiu 1 control pozitiv cu BSA, 0,095% (g/v) azidă de sodiu, detergent și ser uman în PBS 1 control negativ cu BSA, 0,095% (g/v) azidă de sodiu, detergent și ser uman în concentrat tampon de spălare PBS 20x concentrat PBS cu 0,095% (g/v) azidă de sodiu și detergent Tampon de probă cu BSA, 0,095% (g/v) azidă de sodiu și detergent, conjugat IgA galben colorat, Peroxidază anti-IgA umană, substrat enzimatic roșu colorat TMB (3, 3, 5, 5, tetrametilbenzidină) soluție stop, 0,5 MH 2 SO 4, incolor 18
2.2 Dispozitive și consumabile Eppendorf Hamburg - Referință pentru pipete - Multipipete Multipete plus - Combitipp 1,0 ml, 2,5 ml, 5,0 ml Sarstedt Nümbrecht - Vârfuri pentru pipete galben 10 100 µl - Vârfuri pentru pipete albastru 100 1000 µl Vortex - Shaker Genie Ampuwa - Distilat Water SLT - Spectra microtiter plate meter Epson - LX-400 printer Other - computer personal convențional, MS Word 2003, MS Excel 2003 - Synelisa Software Ver. 3.2 iulie 1995 - Programe statistice statistice Winstat și PASW 18 19
2.3 Sere pentru pacienți S-au utilizat seruri pentru pacienți pentru care au fost deja disponibili titruri de IgA. Au fost selectate acele seruri care aveau un titru IgA mai mare de 8 U/ml pentru a evita serurile pozitive la limită (zona gri). Dintr-o populație de 803 pacienți cu diabet zaharat de tip 1, 73 de seruri IgA pozitive de la 44 de pacienți de sex feminin și 26 de bărbați au fost selectați pentru determinarea titrilor IgA și IgG. Sexul nu a putut fi atribuit în 3 eșantioane. Vârsta pacienților variază între 4 și 84 de ani. 25 dintre pacienți au avut un titru IgA mai mare de 100 U/ml. Serul acestor pacienți a fost examinat în continuare cu diluțiile adecvate pentru a cuantifica titrurile anticorpilor. Tabelul 1: Prezentare generală a populației, N = număr Numărul vârstelor N Bărbat Femeie Necunoscut Domeniu Studiu 1 59 20 38 1 4 84 Studiu 2 14 6 6 2 11 83 20
23 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Figura 2: Standarde ale schemei de pipetare: controale negre: alb +/- pacienți: alb, numerotat
2.4.1.3 Reprezentarea grafică a procedurii de testare = antigen uman transglutaminază tisulară recombinantă ca fază solidă Figura 3: Configurare schematică a testului 1 din 10 pipetarea probelor de ser = anticorp transglutaminază tisulară = antigen uman transglutaminază tisulară recombinantă ca fază solidă = alte componente ale celulei Figura 4: Configurare test schematică 2 din 10 24
= Anticorp transglutaminazic tisular, = antigen transglutaminazic uman țesut recombinant ca fază solidă = alte componente celulare Prima reacție: anticorpii transglutaminazei tisulari prezenți în serul pacientului se leagă de antigeni. Anticorp, = uman, antigen transglutaminazic al țesutului recombinant ca fază solidă = alte componente ale celulei Figura 6: Configurarea schematică a testului 4 din 10 25
Pipetare în conjugatul anti-peroxidază umană = conjugat peroxidază anti-uman = anticorp transglutaminază țesut = antigen uman transglutaminază țesut recombinant ca fază solidă Figura 7: Schema de configurare a experimentului 5 din 10 = conjugat peroxidază anti-uman = anticorp transglutaminază țesut = transglutaminază țesut uman, recombinant ca fază solidă a 2-a reacție: conjugatul se combină cu complexul antigen-anticorp. Incubați timp de 30 de minute. Figura 8: Configurarea schematică a testului 6 din 10 26
3 x spălarea din cavitate cu tampon de spălare = peroxidază anti-umană conjugată = anticorp transglutaminază tisulară = antigen uman transglutaminazic tisular recombinant ca fază solidă Figura 9: Setare experimentală schematică 7 din 10 pipetare TMB în substratul enzimatic tetrametilbenzidină = transglutaminază conjugată = peroxid uman, antigen transglutaminazic de țesut recombinant ca fază solidă = tetrametilbenzidină Figura 10: Configurare experimentală schematică 8 din 10, TMB = tetrametilbenzidină 27
= Conjugat peroxidază anti-umană = anticorp transglutaminază tisulară = antigen uman transglutaminazic țesut recombinat ca fază solidă = incubat tetrametilbenzidină timp de 10 minute în întuneric Figura 11: Schema experimentului 9 din 10 = trans-peroxidază anti-umană conjugată = anticorp transglutaminază tisulară = antigen tisular uman, Faza solidă = tetrametilbenzidină H 2 SO 4 = tetrametilbenzidină după schimbarea culorii a 3-a reacție: -Complexele conjugate-anticorp-antigen marcate cu enzime setează substratul să schimbe culoarea substratului de la roșu la galben-reacția este oprită cu acid sulfuric -30 minute după oprire poate fi fotometrică densitățile optice sunt determinate la 450 nm Figura 12: Configurare experimentală schematică 10 din 10, H 2 SO 4 = acid sulfuric 28
Tabelul 2: Test Kolmogorov-Smirnov pentru distribuția normală cu corecție de semnificație în funcție de Lilliefors pentru ttg (iga) și ln [ttg (iga)], ttg (iga) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ln = logaritm la baza e, n = număr Kolmogorov-Smirnov n Semnificație ttg (iga) 73.000 ln [ttg (iga)] 73.032 Figura 13: Histograma valorilor titrului absolut ale ttg (iga) cu curbă de distribuție normală, ttg (iga) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare Figura 14: Histograma logaritmică Valorile titrului pentru baza e a ttg (iga) cu curbă de distribuție normală, ln = logaritm pentru baza e, ttg (iga) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare 31
Figura 15: Histograma valorilor de titru absolute ale ttg (igg) cu curbă de distribuție normală, ttg (igg) = anticorpi de tip G împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (igg) = anticorp tip G împotriva transglutaminazei tisulare 33
3.3 Compararea directă a titrurilor ttg-igg cu ttg-iga Într-o comparație directă a rezultatelor determinării titrului ttg-iga și ttg-igg și a reprezentării grafice comparative a titrilor subiectului testat, devine evident: 93% (69 din 73) din probe au Titru IgA peste cel al IgG; la 7% dintre aceștia (5 din 69) valoarea este semnificativ mai mare decât cea a IgG (vezi Figura 17-24). Cu toate acestea, la 7% (5 din 73) din probe, titrul IgG este mai mare decât cel al IgA (vezi Figura 17-24). Când se analizează graficele cu bare ale IgA și IgG în comparație, sunt evidente următoarele: - Valorile IgA și IgG nu se corelează între ele, i. H. un titru ttg-iga ridicat nu are ca rezultat un titru ttg-igg ridicat. - La fel, un titru IgA scăzut nu este asociat cu un titru IgG scăzut și invers. - Pe de altă parte, dacă titrul IgG este ridicat, și titrul IgA este ridicat. ttg titru IgA-IgG în comparație 900 800 700 600 500 titru 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 număr eșantion ttg (IgA) ttg (IgG) Figura 17: ttg titru IgA-IgG în comparație, numărul eșantionului 1 -10, ttg (IgA) = anticorpi tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (IgG) = anticorpi tip G împotriva transglutaminazei tisulare 34
ttg titru IgA-IgG în comparație 400 350 300 250 titru 200 150 100 50 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Număr eșantion ttg (IgA) ttg (IgG) Figura 18: ttg titru IgA-IgG în comparație, numărul eșantionului 11- 20, ttg (IgA) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (IgG) = anticorpi de tip G împotriva transglutaminazei tisulare ttg titru IgA-IgG în comparație 500 450 400 350 300 titru 250 200 150 100 50 0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Număr eșantion ttg (IgA) ttg (IgG) Figura 19: titru ttg IgA-IgG în comparație, numărul eșantionului 21-30, ttg (IgA) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (IgG) = anticorpi de tip G împotriva țesutului transglutaminazei ttg titru IgA-IgG în comparație 1000 900 800 700 600 titru 500 400 300 200 100 0 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 număr eșantion ttg (IgA) ttg (IgG) Figura 20: ttg titru IgA-IgG în comparație, Numărul eșantionului 31-40, ttg (IgA) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (IgG) = anticorpi de tip G împotriva transglutaminazei tisulare 35
ttg IgA-IgG titru în comparație 300 250 200 titru 150 100 ttg (IgA) ttg (IgG) 50 0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 numărul eșantionului Figura 21: ttg IgA-titru IgG în comparație, numărul eșantionului 41-50, ttg (IgA) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (IgG) = anticorpi de tip G împotriva transglutaminazei de țesut ttg titru IgA-IgG în comparație 1400 1200 1000 titru 800 600 400 200 0 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 ttg (IgA) ttg (IgG) Figura 22: titru ttg IgA-IgG în comparație, numărul eșantionului 51-60, ttg (IgA) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (IgG) = anticorpi de tip G împotriva transglutaminazei țesutului ttg IgA- Titru IgG în comparație 400 350 300 250 titru 200 150 100 50 0 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 număr eșantion ttg (IgA) ttg (IgG) Figura 23: ttg titru IgA-IgG în comparație, număr eșantion 61-70, ttg (IgA) = anticorpi de tip A împotriva transglutaminazei tisulare, ttg (IgG) = anticorpi de tip G împotriva transglutaminazei tisulare 36