Imagistica neinvazivă a candidozei diseminate în protocolul larvelor de pește zebră (tradus în franceză)

rezumat

Dezvoltarea rapidă, dimensiunea redusă și transparența peștilor zebră sunt de un beneficiu considerabil pentru studiul controlului imun înnăscut al infecției 1-4. Aici demonstrăm tehnicile de infectare a larvelor de pește zebră folosind agentul patogen fungic Candida albicans Prin microinjecție, metodologia utilizată recent pentru a implica activitatea fagocitului NADPH oxidază în controlul dimorfismului fungic 5 .

Abstract

Candidoza diseminată cauzată de agentul patogen Candida albicans este o problemă importantă clinic la persoanele spitalizate și este asociată cu o rată de mortalitate atribuibilă de 30-40% 6. Candidoza sistemică este în mod normal controlată de imunitate înnăscută, iar persoanele cu anomalii genetice ale componentelor celulelor imune înnăscute, cum ar fi întrucât NADPH oxidaza fagocitară este mai susceptibilă la candidemia 7-9. Se știe foarte puțin despre dinamica interacțiunii C. albicans cu celulele imune înnăscute in vivo. Studii extinse in vitro au stabilit că, în afara gazdei, C. albicans germinează în interiorul macrofagelor și este rapid distrus de neutrofilele 10-14. Studiile in vitro, deși utile, nu pot rezuma complexul într-un mediu in vivo, care include în timp dinamica nivelurilor de citokine, atașamentele matricei extracelulare și contactele intercelulare 10, 15-18. Pentru a testa contribuția acestor factori în interacțiunea gazdă-agent patogen, este esențial să se găsească un organism model care să vizualizeze aceste aspecte ale infecției neinvaziv într-o gazdă vie intactă.

Larva de pește zebră oferă o gazdă unică și versatilă pentru vertebrate pentru studiul infecției. În primele 30 de zile de dezvoltare, larvele de pește zebră au doar apărări imune înnăscute 2, 19-21, simplificând studiul unor boli precum candidoză diseminată care sunt extrem de dependente de imunitatea înnăscută. Mărimea mică și transparența larvelor de pește zebră permit imagistica dinamicii infecției la nivel celular atât pentru gazdă cât și pentru agentul patogen. Larvele fluorescente transgenice cu celule imune înnăscute pot fi utilizate pentru a identifica tipuri specifice de celule implicate în infecția 22-24. Oligonucleotidele antisens modificate (morfolini) pot fi utilizate pentru a doborî diferite componente imune, cum ar fi NADPH oxidaza fagocitară și pentru a studia modificările ca răspuns la infecția fungică în 5 litri. În plus față de beneficiile etice și practice ale utilizării unei mici vertebrate inferioare, larvele de pește zebră oferă posibilitatea unică de a imagina bătălia intensă dintre agenții patogeni și gazda atât în ​​mod intravital, cât și în culori.

Peștele zebră a fost folosit pentru modelarea infecției pentru o serie de bacterii patogene pentru oameni și a jucat un rol în progrese semnificative în înțelegerea infecției cu micobacterii 3, 25. Cu toate acestea, acest lucru se întâmplă abia de curând când agenții patogeni mult mai mari, cum ar fi ciupercile, au fost folosiți pentru a infecta o larvă 5, 23, 26 și până în prezent nu a existat o descriere vizuală detaliată a metodologiei infecției. Aici, vă prezentăm tehnicile noastre de microinjecție a ventriculului rombencefalic al peștilor zebri primari, inclusiv modificările noastre la protocoalele anterioare. Rezultatele noastre folosind modelul larvelor de pește zebră pentru infecția fungică diferă de studiile in vitro și consolidează necesitatea examinării intera gazdă-patogenecție în mediul complex gazdă, mai degrabă decât sistemul simplificat al cutiei Petri 5.

Protocol

Toate protocoalele și experimentele de îngrijire a peștilor zebră au fost efectuate în conformitate cu protocolul A2009-11-01 al Comitetului de îngrijire și utilizare instituțională a animalelor (IACUC).

1. Vase de injecție cu morfolino și larve

Durata experimentală: * (10-15 minute)

Gradul de dificultate: *

  1. Pentru injecții cu ouă, preparați o soluție de 2% de agaroză în apă sterilă și cuptor cu microunde. Când soluția s-a răcit, turnați o parte din aceasta într-o cutie Petri foarte adâncă (Fisher Scientific) până când este pe jumătate plină. Lăsați să se răcească pe gheață și asigurați-vă că grătarul este nivelat.
  2. Odată ce vasul s-a răcit, se toarnă un strat superior de 15 ml de agaroză 2%. Pulverizați o matriță de injecție cu ouă din plastic canelat (Adaptive Science Tools) cu apă sterilă dintr-o sticlă de pulverizare. Așezați cu grijă partea canelată în jos în matrița fierbinte de agaroză. Când agarul s-a răcit, utilizați o spatulă metalică plană (VWR Scientific) pentru a disocia matrița de agarul mărit. Scoateți încet grila din agaroză. Plăci de ambalare cu injecție embrionară în Parafilm (VWR Scientific) și magazine inversate la 4 ° C.
  3. Pentru injecții cu pești larvați, preparați o soluție de agaroză 2% așa cum este descris. Se toarnă soluția într-o cutie Petri de dimensiuni standard (VWR Scientific) și se lasă deoparte până se solidifică. Înfășurați vasele de injecție larvară în Parafilm și depozitați inversat la 4 ° C.

2. Pregătirea cultivării ciupercilor

Durata experimentală: ** (30 minute)

Gradul de dificultate: **

3. Infecții cu zebră

Durata experimentală: **** (1-3 ore)

Gradul de dificultate: ****

4. Pregătirea peștilor pentru imagistică

Durata experimentală: ** (30 minute)

Gradul de dificultate: **

  1. Se prepară soluția de metan sulfonat de tricaină ca înainte (200 pg/ml). Scoateți peștele infectat și transferați-l în tricaină.
  2. Se prepară 47,9 ml de agaroză cu 0,4% punct de topire scăzut (Scientific VWR) în apă de ou. Încălziți soluția la cuptorul cu microunde. Se răcește la 37 ° C și se adaugă metansulfonat tricaină (200 pg/ml) la amestec
  3. Odată ce peștii sunt imobilizați în sulfonat de metan tricaină, pipetați fiecare pește într-o cutie Petri (VWR Scientific) conținând 0,4% agaroză cu punct de topire scăzut (VWR Scientific).
  4. Apoi, mutați peștele de agaroză cu punct de topire scăzut în puțurile individuale ale unei farfurii cu fund de sticlă (MatTek Corporation) pentru imagistică. Utilizați cât mai puțină agaroză cât mai mică posibil pentru a se topi, astfel încât peștele să fie plat pe fundul vasului. Nu utilizați suficientă tricaină-agaroză pentru a umple cercurile TNS din placa de sticlă.