Inducerea accidentului vascular cerebral ischemic și a ischemiei-reperfuziei la șoareci folosind ocluzia arterei medii

Introducere

Studiul bolilor cardiovasculare, cum ar fi accidentul vascular cerebral, se bazează pe utilizarea modelelor in vivo. Pentru a înțelege posibilele efecte ale ischemiei, toxicității medicamentelor și/sau tratamentului, este necesar să se utilizeze un model adecvat, standardizat, fiabil și reproductibil al bolii care să permită studii comparative între grupurile de tratament. În acest manuscris, folosim șoareci din cauza disponibilității unui număr mare de șoareci transgenici și a modelelor de evaluare standardizate. S-au dezvoltat scoruri de ratare pentru a evalua deficiențele motorii și comportamentale după accident vascular cerebral ischemic experimental și după recuperare 1, 2.

Sunt disponibile mai multe modele de accident vascular cerebral ischemic, cum ar fi ischemia cerebrală globală completă, ischemia globală incompletă, ischemia cerebrală multifocală și ischemia cerebrală focală. Ultimul grup este, de asemenea, categoria de accident vascular cerebral cel mai frecvent la pacienți. Majoritatea ajunurilor sunt inițiate prin formarea unei ocluzii embolice sau trombotice pe sau în apropierea arterei cerebrale medii (ACM). Pe fondul acestor parametri, modelul imită etiologia bolii accidentului vascular cerebral uman și face ca rezultatele obținute să fie foarte relevante 3. Cu toate acestea, traducerea descoperirilor de la modele animale la tratamentul bolilor la om s-a dovedit dificilă. Până în prezent, numai utilizarea activatorului plasminogen al țesutului trombolitic a fost aprobată pentru tratamentul accidentului vascular cerebral ischemic acut 4.

Printre modelele de ischemie cerebrală focală la șoarece, modelul de circulație cerebrală posterioară cerebrală și modelul de tromboză venoasă cerebrală sunt foarte invazive, reducând aplicabilitatea acestora și limitând gama de analize care pot fi efectuate. Cu toate acestea, alte tehnici, cum ar fi modelul embolic, modelul de fotromboză, modelul de accident vascular cerebral indus de endotelină-1 și modelul de ocluzie a arterei cerebrale (OACM) de sutură intraluminală, sunt disponibile pentru utilizare fără astfel de limitări. Modelul MCAO este o tehnică descrisă în acest protocol. Oferă o metodă fiabilă de inducere a ischemiei cerebrale focale, care poate fi ușor reperfuzată și efectuată într-un mod cu randament ridicat. Există două abordări ale acestui model, și anume metodele Zea-Longa și Koizumi. Ele diferă oarecum în modul în care sutura de ocluzie este introdusă în vasculatură. În tehnica Zea Longa, firul este introdus prin artera carotidă externă 5. Tehnica prezentată aici este modificată din procedura Koizumi în care sutura ocluzivă este inserată peste artera carotidă comună 6.

Modelul MCAO a fost aplicat cu succes pentru a evalua diferite evenimente în timpul accidentului vascular cerebral ischemic. După reperfuzie, se poate observa edem cerebral împreună cu defalcarea barierei hematoencefalice. Vârful morții neuronale este de obicei observat la 24 de ore; Cu toate acestea, poate reveni la nivelul inițial după 7 zile 7. La om, sexul și vârsta sunt variabile importante în determinarea rezultatelor accidentului vascular cerebral; acest lucru a fost observat și la șoareci și șobolani 8, 9, 10. Mai multe publicații au arătat modelul MCAO care au folosit eficiența tratamentului 11, 12, 13, 14.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității din Miami, în conformitate cu liniile directoare ale Institutelor Naționale de Sănătate (NIH). Este necesară utilizarea în echipamente sterile și tehnici aseptice.

1. Pregătiți sutura de ocluzie

  1. Utilizați o sutură de 0,21 mm diametru pentru șoareci între 20-25 g și 0,23 mm pentru șoareci între 25-35 g greutate corporală. Alegerea tipului de suturi pentru procedura MCAO se bazează pe greutatea animalelor.
  2. Cu un stilou argintiu, marcați sutura începând de la 9 mm de la vârful acoperit cu silicon. Aceasta va servi drept ghid pentru lungimea instalării.

2. Pregătirea pentru operație

3. Disecția arterei carotide comune și ramificarea internă/externă

4. Pregătirea CCA pentru inserția suturii MCAO

  1. Așezați trei segmente de fir de nailon de aproximativ 4 inci lungime sub CCA. Asigurați-vă că CCA nu este răsucit, deoarece acest lucru ar face drastică introducerea suturii.
  2. În cel mai jos punct posibil, legați cusătura inferioară într-un nod permanent.
  3. Legați cusătura superioară chiar sub joncțiunea ICA/ECA folosind un nod de alunecare detașabil.
  4. Legați cusătura de mijloc folosind un nod de rulare detașabil, dar țineți-o larg deschisă. Este important să lăsați mult spațiu, deoarece acest lucru nu va împiedica introducerea cusăturii.
  5. Cu foarfecele cu arc de microdisecție, faceți o incizie în CCA între suturile inferioară și mijlocie. Faceți incizia de 0,2 mm lângă cusătura inferioară.

5. Ocluzia arterei cerebrale medii

6. Închiderea inciziei și îngrijirea postoperatorie

  1. Anesteziați animalul din nou (urmați instrucțiunile din 2.1) și îndepărtați suturile de închidere a plăgii.
  2. Folosind pense și separatoare de țesuturi, redeschideți incizia și expuneți CCA.
  3. Îndepărtați cu atenție cusătura superioară și trageți ușor cusătura MCAO până când partea acoperită cu silicon este în mijlocul nodului.
  4. Repetați nodul de mai sus pe sutură pentru a preveni scurgerea sângelui prin sutură (nu trebuie să fie un nod de alunecare).
  5. Slăbiți cu atenție nodul din mijloc și trageți sutura peste nodul superior, dar păstrați-l în CCA.
  6. Închideți bine artera nodului superior pentru a bloca fluxul sanguin.
  7. Trageți complet sutura MCAO și închideți strâns nodul din mijloc.
  8. Sutura MCAO poate fi refolosită de mai multe ori. După fiecare utilizare, curățați ușor sutura în etanol 70% pentru a îndepărta contaminanții (de exemplu sânge sau țesut) cu tifon steril. După aceea, puneți sutura într-o pungă de sterilizator și sterilizați-o.
  9. Repetați pașii 6.1-6.4 și monitorizați recuperarea animalelor.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

În plus față de studierea volumului accident vascular cerebral, imunofluorescența poate fi efectuată pentru o varietate de ținte, cum ar fi proteina-2 asociată cu microtubuli (MAP2) pentru afectarea neuronală (3A) sau proteina acidă fibrilară glială (GFAP) pentru astroglioză (3B). Astfel de analize permit în continuare analiza progresiei și recuperării accidentului vascular cerebral, precum și a altor procese implicate în deteriorarea și repararea țesutului accident vascular cerebral.

accidentului
Ilustrația 1: rong> Reprezentarea schematică a fiziologiei arteriale a creierului. Direcționarea inserției MCAO se desfășoară de la artera carotidă comună (CCA) la zona de ocluzie indicată în albastru. (:;: Cusătură mijlocie; BS: cusătură inferioară MS cusătură superioară TS) Zona chirurgicală este la capătul inferior al figurii (formă ovală), iar plasarea cusăturii este indicată de linii negre. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

cerebral
Figura 2: TTC - Colorarea secțiunilor cerebrale. Panoul superior reprezintă colorarea tipică după inserarea falsă. Au fost obținute 90 de minute sau 24 de ore de plăci medii și inferioare de reperfuzie după un MCAO de 60 de minute urmat. Bara de măsurare este de 1 mm.

3 "src ="/files/ftp_upload/54805/54805fig3.jpg "/>Figura 3: Colorarea imunofluorescentă post-AVC a creierului șoarecelui. După o ocluzie de 60 de minute, creierele au fost recoltate timp de 23 de ore și procesate pentru criotăiere de reperfuzie. Cu anticorpi împotriva MAP2 (sus) și GFAP (jos) țesutul a fost analizat pentru leziunile neuronale și astrogloza fie fals (câmpuri stâng), fie creier de 90 min ischemie-reperfuzie (câmpuri dreapta). Imaginile prezentate sunt preluate din mai multe imagini combinate prin microscopie confocală folosind un obiectiv 10X. Bara de măsurare este de 1 mm. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

tabelul 1. Yardstick pentru judecarea mouse-ului - Stare și neurodeficit după accident vascular cerebral de ischemie. Ajustat de la 1, 2.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

În funcție de experiența utilizatorului, această metodă poate fi utilizată într-un mod cu randament ridicat pentru a examina un grup mare de animale. Semnificația statistică a studiilor pe animale depinde de utilizarea unui număr suficient de subiecți între grupurile de tratament, în ciuda recunoașterii diferențelor intrinseci între animalele testate. Protocolul prezentat permite astfel de studii în timp ce re-creează îndeaproape părți ale procesului bolii.

Avantajul tehnicii MCAO este că, deși implică o anumită procedură chirurgicală, nu necesită proceduri foarte invazive, ca în modelul de craniotomie. În plus, este foarte reproductibil, iar reperfuzia este foarte controlabilă, ceea ce nu este posibil cu endotelina-1 sau modelele de accident vascular cerebral embolic. Tehnica imită procesul unui accident vascular cerebral ischemic uman și produce leziuni caracteristice țesuturilor observate la om, ceea ce nu este cazul modelului de fototromboză. Comparativ cu alte tehnici publicate, procedura MCAO nu va necesita cauterizarea ECA. Acesta este un avantaj, deoarece poate fi combinat cu modelul nostru de perfuzie ICA pentru a livra agenți terapeutici în emisfera afectată după inducerea accidentului vascular cerebral 23, 24, 25.

În plus față de analiza țesuturilor, comportamentul animalului poate fi monitorizat pe lungime pentru a evalua severitatea accidentului vascular cerebral și recuperarea. Acest lucru poate ajuta la compararea recuperării între diferitele grupuri de tratament. Au fost dezvoltate mai multe abordări pentru a evalua comportamentul. O scală simplă în 5 puncte poate fi utilizată pentru a evalua deficitul neurologic după accident vascular cerebral (0: fără deficit de comportament; 1: fără extensie contralaterală a forepaw; 2: încercuind pe partea opusă a infarctului; 3: capcane pe partea opusă a infarctului; 4: Nivel scăzut de conștientizare și mișcare spontană) 5. În plus, se poate efectua o analiză aprofundată a stării și comportamentului animalului pentru a evalua recuperarea ca 2 în tabelul 1 1 descris.

Procedura chirurgicală prezentată utilizează o procedură mecanică pentru inducerea accidentului vascular cerebral, care în studiile privind susceptibilitatea accidentului vascular cerebral limitează utilizarea acestei tehnici și/sau a agenților patogeni. Cu toate acestea, acest protocol poate fi remarcabil de util în analiza severității accidentului vascular cerebral, a strategiilor sale de evitare sau limitare, a factorilor agravanți și a posibilelor abordări terapeutice după accident vascular cerebral. Comparația între grupurile de tratament poate ajuta la identificarea potențialelor tratamente care pot minimiza leziunile accidentului vascular cerebral sau recuperarea rapidă. Într-adevăr, a ajuta pacienții cu AVC să îmbunătățească recuperarea ar fi de o mare importanță.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.