Influența metotrexatului asupra metabolismului homocisteinei Studii asupra leucemiei și
1 Influența metotrexatului asupra metabolismului homocisteinei: studii asupra pacienților cu leucemie și limfom Disertație pentru obținerea diplomei de doctorat (Dr. rer.nat.) A facultății de științe matematice și naturale a Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn prezentată de ACHIM BECKER de la Trier Bonn 2004
2 Pregătit cu aprobarea Facultății de Matematică și Științe ale Naturii din Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Această disertație este publicată electronic pe serverul de publicații al universității de la ULB Bonn. 1. Vorbitor: Prof. Dr. U. Jaehde Vorbitor al 2-lea: Prof. Dr. Ziua de absolvire a lui G. Benda:
4 Aș dori în mod special să îi mulțumesc prietenei mele Jutta Schneider pentru răbdarea și dorința de a ajuta, mai ales în faza finală a lucrării. În cele din urmă, aș dori să le mulțumesc mamei mele și fraților mei, care m-au susținut mereu și mi-au oferit întotdeauna sprijin de încredere chiar și în momentele dificile.
5 Îndoiala mea de familie nu este una confortabilă, dar certitudinea este una absurdă. Voltaire
6 Cuprins 1 Introducere Homocisteină Metabolizarea homocisteinei Cauze ale hiperhomocisteinemiei Simptome clinice de hiperhomocisteinemie și recomandări terapeutice Patomecanisme Metotrexat Structură chimică Farmacocinetică Mecanism de acțiune Aplicații clinice Neurotoxicitatea MTX Problemă și obiectiv Material și metode Materiale Produse chimice și reactivi Soluții utilizate și tampoane Consumabile Dispozitive Analiză CE. 35
7 Cuprins Bazele electroforezei capilare Dezvoltarea unui sistem de separare pentru determinarea aminoacizilor excitatori care conțin sulf (SEAA) Dezvoltarea metodei Optimizarea metodei pentru determinarea SEAA în lichid Validarea metodei CE Măsurarea probelor de lichior Analiza HPLC Sistemul HPLC și condițiile cromatografice Reducerea și derivarea precolumnică a aminotiolilor -validarea metodei de optimizare a măsurării eșantioanelor de LCR principiul de imunoanaliză a polarizării fluorescenței principiul măsurării imunoanalizei de polarizare a fluorescenței executarea specificațiilor de măsurare ale sistemului IMx validarea metodei FPIA de către producător validarea parțială a metodei FPIA pentru determinarea homocisteinei la examinările clinice plasmatice pacienții pediatrici cu leucemie limfatică acută. 68
8 Cuprins Pacienți adulți cu limfom primar al sistemului nervos central Adulți sănătoși (grup de control) Raport de caz al unui pacient cu supradozaj MTX Calcule farmacocinetice Clearance ASC Analiza datelor statistice Statistici descriptive Testele statistice pentru testarea ipotezelor diferențiale Analiza de corelație Analiza de regresie Rezultate Metoda CE pentru determinarea aminoacizilor excitatori care conțin sulf în Separarea CSF a aminoacizilor excitatori care conțin sulf Optimizarea derivatizării Comparația sensibilității detectării UV și LIF Optimizare metodă pentru analiza CSF Validare Metodă HPLC pentru determinarea cisteinei, homocisteinei și glutationului în LCR. 111
9 Cuprins Dezvoltarea/optimizarea metodei Validarea metodei HPLC Rezultate ale validării parțiale a FPIA Influența dozei mari de MTX asupra metabolismului homocisteinei Investigații la copii și adolescenți cu leucemie limfoblastică acută (Studiu Total XV) Investigații la pacienți cu PZNSL Raport de caz al unui pacient cu supradozaj MTX Discuție Metodă CE pentru determinarea aminoacizilor sulfuroși, excitatori în metoda HPLC CSF pentru determinarea homocisteinei, cisteinei și glutationului în CSF Influența unei chimioterapii cu doze mari MTX asupra metabolismului homocisteinei Studii la pacienții pediatrici cu ALL Studii la pacienții cu PZNSL Studiu de caz al unui Pacient cu supradozaj MTX Homocisteina un biomarker al neurotoxicității induse de MTX? Apendice privind literatura de specialitate. 222
10 Lista abrevierilor ABDF AG AICAR AICAR-TF AK AL ALL ASP ATP BHMT C1 (8), (15) C1h23 (42) C15h23 (42) CA CBQCA CBS CGL CFSE cp ss CNS CSA CV CYS DAMPA DHB DHF DHFR DHP DHPR DHPR 4- ( Aminosulfonil) -7-fluor-benzofurazan antigen aminoimidazol-carboxamidă-ribonucleotidă aminoimidazol-carboxamidă-ribonucleotidă transformilază anticorpi soluție de lucru leucemie limfatică acută acid L-aspartic (aspartat) adenozină trifosfat betaină homocisteină 1 zi sau 8th de consolidare Prima zi de consolidare, 23 (42) ore după începerea perfuziei cu doză mare de MTX A 15-a zi de consolidare, 23 (42) ore de la începutul perfuziei cu doză mare de MTX Acid cisteină sulfonic 4- (2-formil-3-chinolin carbonil) -acid benzoic cistationină-ß-sintază cistationină-γ-liază 5-carboxifluoresceină succinimidil ester concentrație în starea de echilibru în sistemul nervos central plasmatic (sistemul nervos central) cisteină acid sulfinic coeficient de variație (coeficient de variație) cisteină 2,4-diamino-N 10-metil-p acid teroic dihidrobiopterină acid dihidrofolic (dihidrofolat) dihidrofolat reductază dihidropteridină dihidropteridină reductază
11 DMF DTT E ECD EDTA EOF FD FDA FGAR FICAR FITC FPGS FPGH FPIA FQCA FR GAR GAR-TF GLU GSH GTP HCY HCSA HCA HDMTX HR ICV ICVMTX IMP IT ITMTX IV N, N-dimetilformamidă Detecție electrochimică Detectie electrochimică Food & Drug Administration Formylglycinamidribonukleotid 5-formamido-imidazol-4-carboxamidribonukleotid fluoresceină acid folic-folat Polyglutamatsynthetase Polyglutamathydrolase polarizare fluorescentă immunoassay 3- (2-furoil) chinolin-2-carbaldehidă folat receptor Glycinamidribonukleotid Glycinamidribonukleotid transferaza acidului glutamic (glutamat) glutation guanozin trifosfat homocisteina Homocysteinsulfinsäure Acid homocisteină sulfonic Terapie cu doze mari cu metotrexat (administrat intravenos) Metotrexat administrat intracerebroventricular intracerebroventricular cu risc crescut Inosină monofosfat intramuscular Metotrexat administrat intratecal Administrare intravenoasă
12 K KPF LDL LIF (D) LLOQ LOD LR MAT ME MP MEKC MeOH mfbp MS MTHFR MTX MTX Grup de control Zona de vârf corectată Lipoproteine cu densitate scăzută Fluorescență indusă de laser (detectare) Limită inferioară de cuantificare (limită inferioară de cuantificare) Limită de detecție (limită de detecție) Scăzută -Risc metionină adenozil transferază mercaptoetanol mercaptopropanol Cromatografie electrocinetică micelară proteină metanolică legată de folat proteină metionină sintază N 5, N 10 -Metilen tetrahidrofolat reductază metotrexat metotrexat poliglutamat (e) µ mobilitate electroforetică mobilitate electroforetică N 5 -FTHF N 10 -FTHF NHL N 5, N 10 -MTHF N 5 -MTHF NMDA PRPP PO PZNSL QC-Probe r N-acetilcisteină N 5 -formil tetrahidrofolat N 10 -formil tetrahidrofolat Limfom non-Hodgkin N 5, N 10 - Metilen tetrahidrofolat N 5-metil tetrahidrofolat N-metil-D-aspartat α-5-fosforibozil-1-pirofosfat per os (oral) Limfom primar al Ne central rvensystems controlul calității coeficientul de corelare a eșantionului
13 RE RFC RI ROS RSD S SD SAH SAHH SAM SBDF SDS SEAA SHR SL SR ss t ½ TBP THB THF TIT ULOQ v VK Eroare relativă (eroare relativă) Remisiune/inducție a purtătorului de folat redus Specii de oxigen reactiv Abaterea standard relativă (coeficient de variație) Abaterea standard standard (Deviație standard) S-adenosilhomocisteină S-adenosilhomocisteină hidrolaza S-adenosilmetionina 4- (sulfo) -7-fluor-benzofurazan sodic dodecil sulfat Aminoacizi excitatori cu conținut de sulf (aminoacizi constanți care conțin sulf, aminoacizi stabili excitatori) Timp de înjumătățire Tributilfosfină Tetrahidrobiopterină Acid tetrahidrofolic (tetrahidrofolat) Terapie triplă intratecală Limită superioară de cuantificare (limită superioară de cuantificare) Viteză de migrare Coeficient de variație x valoare medie x
Median Z Coeficient de corelație transformat SNC Sistemul nervos central
19 Page 6 Introducere Lipsa fructelor și legumelor proaspete, deficitul de folat este cel mai frecvent deficit de vitamine din Europa. Aportul zilnic mediu de folat cu alimente (
25 Page 12 Introducere Reacțiile neurotoxice mediate de homocisteină pot fi reduse semnificativ prin administrarea de antagoniști ai receptorilor NMDA 67,71,72. Cl - canal Ca 2+ kainat canal NMDA AMPA mglu Na + Na + Na + PLC Cl - Ca 2+ IP 3/DAG proteaze (Kalpaine I/II), fosfolipaze (PLA 2, PLC), endonucleaze, protein kinaze (CaMPK II, PKC), NO peroxidare lipidică sintază, deteriorarea citoscheletului, ADN-ului și mitocondriilor Liza osmotică, apoptoza Fig. 1-3: Mecanismul excitotoxicității. Abrevieri: Kainate: receptorul Kainate; NMDA: N-metil-D-aspartat (receptor); AMPA: acid L-α-amino-3-hidroxi-5-metilizoxazol-4-propionic (receptor); mglu: receptor de glutamat metabotrop; PLC: fosfolipază C; IP 3: inozitol trifosfat; DAG: Diacilglicerol Se discută, de asemenea, că modificările aterosclerotice induse de homocisteină în vasele cerebrale ar putea duce la ischemie și hipoxie și, prin urmare, neuronii ar putea fi deteriorați 77. Cisteina este, de asemenea, suspectată de a provoca efecte neurotoxice în concentrații mai mari. vin atunci când bariera hematoencefalică sau a lichiorului sângelui este afectată de o infiltrare cu tumori sau de radiații și cantități mai mari de cisteină pot pătrunde din sânge în SNC.
29 Page 16 Introducere au ca MTX și sunt, de asemenea, capabili să inhibe direct enzimele biosintezei purinei, sunt de o mare importanță pentru citotoxicitate. HNN NH 2 NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O COOH MTX carboxipeptidază aldehidă oxidază HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 acid folic poliglutamat sintetază HOOC HN HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 OO 2,4-diamino-N 10-acid metilpteroic ( DAMPA) HNN COOH NH 2 7-hidroximetotrexat (7-OH-MTX) NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O CO (GLU) n Metotrexat poliglutamat (MTX-PG) Fig. 1-5: Metabolismul MTX.
32 Introducere pagina 19 Ribonucleotidă glicinamidică (GAR) sau ribonucleotidă 5-aminoimidazol-4-carboxamidă pentru a sta în picioare. 2- O3 PO CH 2 O PRPP OH OOOPOPO - OH O - O - OH 2 NH 2 NN AICAR N Riboză P 2- O3 PO CH 2 OH O HN OH C CH 2 O GAR NH 2 AICAR-TF X MTX-PG ON 10 -FTHF THF GAR-TF MTX-PG XN 10 -FTHF THF OH 2 N CH HN N FICAR N Riboză PH 2 CCOHN CH O NH Riboză P FGAR OH 2 O HN NN IMP N Riboză P Fig. 1-7: Interacțiunea dintre MTX-PG cu sinteza de novo a bazelor purinice (pași selectați). Abrevieri: PRPP: α-5-fosforibosil-1-pirofosfat, GAR: ribonucleotid amidă glicină, GAR-TF: transformilază GAR, FGAR: ribonucleotid amidă formilglicină, N 10-FTHF: N 10 -formil tetrahidrofolat, THF: tetrahidrofol 4-carboxamidă ribonucleotidă, AICAR-TF: AICAR transformilază, FICAR: 5-formamido-imidazol-4-carboxamidă ribonucleotidă, IMP: inozin monofosfat.