Injecție de insulină și extracție de hemolimfă pentru măsurarea sensibilității insulinei la Drosophila la adulți

rezumat

Căile de semnalizare a insulinei conservate găsite în musca fructelor Drosophila melanogaster fac din acest organism un instrument potențial pentru modelarea bolilor metabolice, cum ar fi diabetul de tip II. În acest scop, este important să se stabilească teste fiziologice pentru a măsura efectele sistemice ale insulinei asupra glucozei periferice disponibile la muștele adultului.

Abstract

Protocol

1. Insulina care face soluția

  1. Pregătiți insulină bovină proaspătă prin dizolvarea insulinei în PBS pentru a obține concentrația de 0,01 mg/ml. Atât insulina/PBS, cât și soluțiile de control PBS trebuie păstrate pe gheață în timpul injecției. Aceste soluții nu trebuie preparate cu 0,5% (v/v) FD&C Blue. 1 colorant alimentar.

2. Pregătirea acului și montarea injecției

  1. Pentru experimentele de injectare se folosesc muște femele în vârstă de zece zile. Adună muștele în decurs de 24 de ore de la eclozare. Anesteziați muștele cu CO 2 umezit pe un strat de gaz, sortați masculii și plasați muștele femele în flacoane cu dietă standard sau de tratament. Păstrați muștele femele pe diete experimentale timp de 10 zile.
  2. În a zecea zi după eclozare și separare pe dietele experimentale, muștele sunt transferate din flacoanele care conțin alimente în flacoane cu un dop de 5 ml conținând 2% agar și le înfometează timp de 12-16 ore.
  3. Transferați fiole de muște înfometate cu filtre înmuiate în glucoză 10% timp de 1 oră înainte de injectarea insulinei.
  4. Anesteziați scurt muștele cu CO 2 umidificat după aportul de glucoză și apoi imobilizați-le reci pe gheață.

  1. Prindeți o muscă imobilizată la rece cu o pință fină și țineți vârful acului aproape, astfel încât vârful să fie lângă zona frontală a părții stângi a toracelui mustei. Aduceți atât vârful acului, cât și toracele cu muște în focalizare sub stereo microscop.
  2. Deplasați musca spre vârful acului, astfel încât vârful acului să atingă centrul cuspizilor din regiunea prescutului stâng al toracelui zbura (Fig. 1). După ce musca este orientată corespunzător și în conformitate cu punctul acului, musca continuă pe ac, astfel încât acul să împingă centrul prescutului în față.
  3. Aplicați presiune pozitivă avansând pistonul seringii cu microinjectorul folosind butonul micromanipulator până când 0,1 μl de lichid a fost injectat din mers. Fluxul de lichid din hemocoelul cu muște va conferi o culoare albastră pe partea stângă a toracelui anterior. Ocazional trebuie să vă retrageți și să avansați de mai multe ori pentru a slăbi toate blocajele punctului acului și a permite un flux.
  4. Lăsați muștele injectate în flacoane de 2% agar pentru anumite momente de timp pentru a se recupera înainte de extracția hemolimfei.

6. Determinarea glucozei hemolimfei

  1. Ejectați probele de hemolimfă în godeurile plăcii de microtitrare cu 100 μl de reactiv Infinity Glucose. Păstrați placa pe gheață atunci când încărcați probe de hemolimfă.
  2. Faceți o curbă standard încărcând separat 1 μl din fiecare soluție stoc de glucoză la 50mm, 25mm, 12,5mm, 6,25mm și 3,125mM.
  3. Se incubează probele la 37 ° C timp de 10 minute.
  4. Detectați absorbția la 340 nm.
  5. Contabilizați volumul hemolimfei colectate și determinați concentrația de glucoză eșantion pe baza curbei standard cu concentrații cunoscute de glucoză.

7. Rezultate reprezentative

Un răspuns tipic de toleranță la insulină este în muștele de injecție cu insulină, unde se detectează o scădere a nivelurilor de glucoză circulante la 15 minute după injecție. În schimb, o astfel de reacție nu este la muștele injectate cu PBS (Fig. 3). Această reacție la nivelul glucozei periferice disponibile în injecția cu insulină continuă să zboare până la 30 de minute după injecție. Extragem în mod obișnuit 0,2-0,5 μl de hemolimfă la 4-5 muște în fiecare grup de injecție. Trei grupuri de injecție sunt incluse în fiecare experiment.

insulină
ilustrația 1. Partea stângă a toracelui Drosophila care prezintă locul de inserare a acului (Modificat din Demerec, 1950) 7. Introduceți acul prin centrul prescutului pe porțiunea anterioară, posterioară a părții stângi a toracelui.

insulină
Figura 2. Vedere din față a capului Drosophila care prezintă locul puncției pentru extracția hemolimfei (modificat din Demerec, 1950) 7. Puncția capsulei capului cu o sondă de tungsten fin măcinată în centrul capsulei deasupra suturii ptilinale.

injecție
Figura 3. Un răspuns tipic de toleranță la insulină detectat la adulții martor este muștele. Control-w 1118 muște au fost injectate cu insulină bovină (1 ng în PBS) sau numai PBS. Muștele din grupurile replicate au fost apoi măsurate timp de 0, 15 sau 30 de minute și au circulat din nou nivelurile de glucoză.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Tehnica descrisă în acest raport este potențial utilă în orice studiu care examinează procesele fiziologice care au ca rezultat modificări detectabile ale compoziției hemolimfei Drosophila. Combinând injecția și colectarea hemolimfelor în acest mod, este posibil să se determine efectele imediate relevante fiziologic ale unui anumit tratament sau manipulare experimentală. Avantajul principal al acestei tehnici de „scurgere de sânge” în colectarea hemolimfelor în comparație cu procedurile anterioare care implică decapitarea 2 este că această tehnică minimizează contaminarea specimenelor de hemolimfă cu conținut bun. apar colectează picături de hemolimfă radiate, apoi probele trebuie să reflecte cu exactitate starea fluidelor circulatorii in vivo.

Un factor potențial confuz efectuat ca urmare a unui experiment de injecție pe această scară este prima diluare a fluidelor circulatorii totale după injecție. Acest lucru poate fi controlat cu ușurință, dar după injectarea aceluiași volum de PBS în muște experimentale sau insulină în controale potrivite pentru vârstă și rezultate normalizate. Pentru a asigura citiri de glucoză circulante reproductibile, calitatea picăturilor de hemolimfă este de o importanță capitală. Pentru determinarea glucozei trebuie înregistrate numai picături clare de hemolimfă fără corpuri adipoase pericerebrale sau alte resturi de țesut. De asemenea, este de remarcat faptul că numai până la 8 probe trebuie colectate înainte de determinarea concentrațiilor relative de glucoză. Am observat o „deriva” în citirile OD 340 când probele de hemolimfă au fost lăsate pe gheață pentru o perioadă extinsă de timp.

Protocolul nostru lasă mult spațiu pentru schimbarea echipamentelor disponibile. Setările extragerii de pipetă trebuie modificate în funcție de modelul și starea extragerii. Am constatat că setările pentru realizarea acelor electrod de absorbție intracelulară adecvate sunt ideale pentru ace hipodermice. În plus, în timp ce am folosit un micromanipulator cu trei axe pentru menținerea poziției acului sub stereoscop, acest lucru poate fi realizat și cu un suport de inel stabil și un sistem de prindere atunci când acul rămâne într-o poziție fixă ​​prin procesul de injecție. Rezistența ridicată a acelor a folosit dezvoltarea unei metode alternative pentru determinarea volumului lichidului injectat ca mișcare a pistonului de seringă 1: 1 pentru a nu realiza deplasarea volumului. Am dezvoltat o scară care ar putea fi tipărită și arborată pe partea laterală a acului. În funcție de sistemul utilizat, poate fi necesară deplasarea unui lichid din ac dincolo de suportul de ac al microinjectorului, astfel încât lichidul de menisc să poată fi aliniat cu gradații folosind cardul de calibrare atașat pe partea laterală a axului acului.

În cele din urmă, două limitări ale acestei tehnici sunt notate în protocolul nostru. În primul rând, două persoane sunt de obicei necesare pentru a coordona atât etapele de injectare cât și cele de extracție a hemolimfei pentru a maximiza numărul de probe prelucrate. În al doilea rând, variațiile răspunsului la toleranța la insulină sunt uneori observate în cadrul aceluiași genotip. Credem că acest lucru, prin răspunsuri variabile, muștele individuale pot urma imobilizarea și recuperarea gheții pe agar. Prin urmare, un număr suficient de eșantioane ar trebui testat înainte de a putea trage concluzii fiabile.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.