Investigarea genetică moleculară la nivel de genom a variațiilor numărului de copii ADN (CNV) în
De la Institutul pentru Neuropatologie al Facultății de Medicină Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTARE Investigație genetică moleculară la nivel genomic a variațiilor numărului de copii ale ADN (CNV) în carcinoamele colangiocelulare pentru obținerea diplomei academice Doctor medicinae (Dr. med.) Prezentat la Facultatea de Medicină Charité Universitätsmedizin Berlin de Alexander Arnold Data doctoratului Ramenskoye: 09.09.2016
Figura 1-1 Clasificarea subtipurilor de colangiocarcinom în intrahepatic și extrahepatic (perihilar și distal) pe baza locației anatomice conform clasificării UICC. Modificat din Blechacz și colab., 2011 (10) 1.3 Epidemiologia colangiocarcinomului Incidența carcinomului colangiocelular, care reprezintă 3% din totalul tumorilor gastrointestinale, crește la nivel mondial (12, 13). Cu toate acestea, incidența variază foarte mult între țări, cu o rată de 1-2/100.000 în Europa de Vest și de până la o sută de ori mai mare în Asia de Sud-Est (14). Diferenți factori de risc local și condiții genetice sunt considerați responsabili pentru această discrepanță (15). Atât în colangiocarcinoamele intra, cât și în cele extrahepatice, bărbații sunt afectați mai frecvent decât femeile din întreaga lume, cu un raport de 1,5 (14). În ambele subtipuri, cei mai mulți dintre cei afectați au vârsta peste 65 de ani când se pune diagnosticul (16). Cu toate acestea, pacienții se află în țări cu o incidență mai mare (Asia de Sud-Est) 7
Figura 1-2 Clasificarea macroscopică a colangiocarcinoamelor intrahepatice conform Grupului de studiu al cancerului hepatic din Japonia (LCSGJ). Blechazc și colab., 2011 (10) În cazul colangiocarcinoamelor extrahepatice, se face din nou o distincție între un model de creștere exofitic și intraductal (42), ambele tipuri fiind asociate cu invazia perineurală și implicarea ganglionilor limfatici (10). Pentru clasificarea histologică a colangiocarcinoamelor, în plus față de clasificarea OMS, există ediția actuală a AJCC/UICC, care descrie adenocarcinoamele ca fiind forma cea mai frecventă, precum și forme mai rare (carcinoame adenocuamoase și scuamoase, mucinoase, asemănătoare celulei inelului sigiliu, sarcomatoase, limfoepiteliomatoase) și celule clare 43, 44). Cea mai comună formă de carcinom colangiocelular este adenocarcinomul moderat spre bine diferențiat, care se caracterizează printr-o structură glandulară sau tubulară. Aici, celulele epiteliale cubice sau coloane modificate anaplastic prezintă o citoplasmă eozinofilă cu nucleoli centrali rotunzi. Celulele tumorale eterogene se răspândesc adesea de-a lungul pereților căilor biliare și ale tecilor nervoase (45). 11
Pentru tratamentul farmacologic al colangiocarcinomului, nu a existat chimioterapie standardizată până în 2010 din cauza datelor insuficiente. O monoterapie frecvent utilizată cu gemcitabină a dat doar rezultate nesatisfăcătoare (98). Cu studiile NCRI ABC-01 și ABC-02 din Anglia, cu toate acestea, a fost stabilită o terapie potențială de stabilire a tendințelor constând din gemcitabină și cisplatină pentru tumorile nerezecabile ale sistemului de canale biliare (99, 100). Rezultatele acestor studii ar putea fi confirmate și de un studiu comparabil din Japonia (101). Anticorpii monoclonali care intervin în mod specific în procesele moleculare sunt, de asemenea, noi abordări terapeutice (102). Punctele lor de plecare actuale și rezultatele cercetărilor mai recente vor fi examinate în continuare în secțiunea de discuții. 19
3 Material și metode 3.1 Pacienți și probe tumorale Pentru examinările individuale, au fost disponibile diferite colective de probe tumorale, care sunt prezentate în detaliu. 1. Pentru analiza prin intermediul sondei de inversiune moleculară (MIP), imunohistochimie și hibridizare fluorescentă in situ (FISH), au fost utilizate 24 de probe tumorale fixate în formalină încorporate în parafină (FFPE) din arhivele Institutului de patologie, Charité - Universitätsmedizin Berlin. Toate probele au fost determinate pentru examenul MIP și imunohistochimic și 20 de probe selectate pentru analiza FISH (Tabelul 3-1). Tabelul 3-1 Populația tumorală FFPE. 21
2. Pentru investigația utilizând RT-PCR, 30 de probe de tumoră crioconservate, care după îndepărtarea chirurgicală au fost congelate prin șoc în azot lichid și depozitate la -80 C, din arhivele Clinicii de chirurgie generală, viscerală și de transplant, Charité - Universitätsmedizin Berlin ( Tabelul 3-2). Acest colectiv include numai colangiocarcinoamele intrahepatice. Tabelul 3-2 Populația de tumori crioconservate. 22
Datorită tehnologiei moderne multiplex, peste 20.000 de MIP-uri pot rula procesul printr-o singură abordare și astfel pot fi analizate. Figura 3-2 Secvența de reacție a abordării MIP: (1) Legarea MIP la ADN-ul genomic (2) Umplerea lacunelor prin polimerizare (3) Ligarea capetelor omoloage ale MIP (4) Exonucleaza elimină probele nereacționate (5) Eliberarea probei (6) ) Amplificarea MIP utilizând PCR. Modificat din Hardenbol și colab., 2003 (105) 26
Figura 3-3 Rezumatul fluxului de lucru MIP. Modificat conform Hardenbol și colab., 2003 (105) Material și soluții: Pentru efectuarea examinării MIP, 75 ng din ADN-ul tumorii genomice extrase anterior au fost transferate într-o soluție apoasă. Executare: Hibridizare pe matricea OncoScan TM FFPE Express 2.0. Metoda Molecular Inversion Probe a fost realizată de Affymetrix (Santa Clara, SUA). 3.5 Analiza datelor despre numărul copierii utilizând software-ul Nexus Copy Number Fiecare eșantion din matricea MIP definește o localizare de-a lungul genomului, care este determinată de intensitatea fluorescenței MIP-urilor. voi. Transformarea intensității semnalului în modificări ale numărului de copii se numește segmentare. Algoritmul SNP-FASST2, care este utilizat de software-ul Nexus, corelează intensitatea matricei din experiment cu un control intern și îl transformă utilizând logaritmul la baza 2 (log2). În acest caz, doar probele non-tumorale sunt grupate ca martori, care servesc apoi ca un semnal de referință cu care fiecare probă tumorală este comparată într-un proces pas cu pas. În consecință, rezultă o ștergere la o anumită locație a unui SNP 27
într-o intensitate a semnalului mai mică comparativ cu cea de referință, în timp ce o amplificare duce la un semnal crescut (Figura 3-4). Figura 3-4 Reprezentarea schematică a atribuirii intensității semnalului unui MIP la o locație de-a lungul cromozomului. Manualul numărului de copiere Nexus (NUMĂRUL DE COPIE NEXUS, Biodiscovery, Hawthorne, SUA) Pentru fiecare eșantion, aceste valori log2 sunt afișate pe axa x ca locație a eșantionului și pe axa y ca valoare a raportului logaritmului (Figura 3-5). Figura 3-5 Exemplul rezultatelor unui experiment și reprezentarea acestuia ca grafic de-a lungul genomului. Manual de copiere Nexus (NUMĂR DE COPIE NEXUS, Biodiscovery, Hawthorne, SUA) 28
Figura 3-6 Reprezentarea schematică a frecvenței alelei B. Manualul numărului de copiere Nexus (NUMĂRUL DE COPIE NEXUS, Biodiscovery, Hawthorne, SUA) Aceste informații despre starea numărului de copiere și raportul de alele permit software-ului să apeleze semnale de intensitate. Următorul tabel 3-3 explică modul în care semnalele trebuie interpretate. În cazul câștigării unui număr unic sau multiplu, se așteaptă să se vadă un dezechilibru alelic în diagrama de frecvență a alelelor. Câștigul poate fi rareori atât de puternic încât aproape că deplasează prezența celeilalte alele, oferind imaginea unui LOH. Pierderea unei copii a unei alele va apărea ca o LOH, în timp ce o pierdere homozigotă ar apărea ca o pierdere alelică totală. Combinația dintre starea numărului de copie neschimbată și o LOH în diagrama de frecvență a alelelor indică o LOH neutră a copiei. Acest proces, cunoscut și sub numele de disomie uniparentală (UPD), are loc atunci când ambele alele sunt transmise de către un părinte. 30
Tabelul 3-3 Rezultate de așteptat la combinarea stării numărului de copiere și a frecvenței alelei B. Manual Nexus Copy Number (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, SUA) Implementare: Datele brute au fost analizate utilizând software-ul Nexus 6 Copy Number (Biodiscovery, El Segundo, CA) cu versiunea NCBI 36.1 a genomului uman. Pentru aceasta a fost ales algoritmul de segmentare SNP-FASST2. 3.6 Reacția în lanț a polimerazei (PCR) Tehnica in vitro a PCR permite duplicarea țintită a secvențelor de ADN care sunt încadrate de segmente de ADN cunoscute. Zona ADN-ului care trebuie reprodus este delimitată de primerii produși artificial care servesc drept ajutor de pornire. Primerii sunt molecule de ADN scurte, monocatenare, care sunt complementare capetelor unei secvențe definite a șablonului de ADN. După denaturarea inițială a ADN-ului cu catenă dublă în două catene simple și recușirea ulterioară a primerului, ADN-polimeraza se extinde în condiții de reacție predeterminate și în prezența a 31
IDH-2 înainte: 5 -AGAATTTTAGGACCCCCGTCTG-3 IDH-2 invers: 5 -AAAACCCCACTTCTGGTAAA-3 3.7 Electroforeză pe gel de agaroză Produsul PCR rezultat este detectat prin separarea fragmentelor de ADN utilizând electroforeza pe gel. Aplicarea unui câmp electric pe gel determină migrarea segmentelor de ADN către anod datorită reziduurilor lor de fosfat încărcate negativ. După colorarea benzilor ADN cu bromură de etidiu, un colorant fluorescent care se intercalează cu ADN-ul, benzilor ADN individuale li se poate atribui o anumită dimensiune folosind un standard. Material și soluții: gel de agaroză 2% (SERVA, Heidelberg, Germania) cu 100μL bromură de etidiu per 100 ml soluție de gel 50 x tampon TAE (AppliChem, Darmstadt, Germania). Procedură: Produsele PCR au fost încărcate pe un gel de agaroză 2% și, după aplicarea unei tensiuni de 100V, timp de aproximativ 20 min. separate prin electroforeză pe gel. 3.8 Purificarea PCR pentru secvențiere Pentru a evita suprapunerea semnalului în timpul secvențierii, produsul PCR trebuie purificat din grunduri, exces de nucleotide, săruri și Taq polimerază înainte de reacția de secvențiere. 33
Material și soluții: 3,85 μl aqua bidest 0,1 μl 1U/μl SAP 0,05 μl 1U/μl 200U/μl Exo I 0,5 μl Exo I tampon 0,5 μl SAP tampon 5 μl produs PCR Procedură: Pentru purificarea enzimatică, amestecul de reacție cu un volum total de 10 μL a fost plasat în ciclorul termic timp de 30 de minute. la 37 C și apoi timp de 15 min. încălzit la 85 C. 3.9 Secvențierea ADN Metoda de secvențiere conform Sanger și colab. (106, 107), care este cunoscută și sub denumirea de metoda de terminare a lanțului sau dideoxinucleotidă, este posibil să se analizeze cdna monocatenară și gdna, care sunt prezente ca o singură catenă în reacția de secvențiere din cauza denaturării. Prin utilizarea dideoxinucleotidelor marcate cu fluorescență (fiecare dintre cele patru ddntps este cuplat la un marker de fluorescență diferit), reacția de secvențiere poate avea loc într-un amestec de reacție, deoarece detectarea benzilor pentru fiecare dintre cele patru ddntps are ca rezultat un semnal de culoare diferit. Material și soluții: 2 μl 10 mm grund TP362/TP363 2 μl produs PCR purificat enzimatic 8 μl aqua bidest 34
Verificați amplificările și pierderile în secțiunile ADN. Interfațele FISH au fost efectuate pe secțiuni TMA folosind kitul de accesorii Histology FISH (Dako, Hamburg, Germania) conform instrucțiunilor producătorului. Sondele FISH enumerate în Tabelul 3-4 au fost utilizate pentru a detecta amplificări și ștergeri. Hibridizarea a avut loc în mașini automate de hibridizare (Dako, Hamburg Germania) și a fost oferită cu amabilitate de Dr. Dido Lenze, Institutul de Patologie, Charité - Universitätsmedizin Berlin. Tabelul 3-4 Rezumatul sondelor FISH utilizate Detecția și cuantificarea semnalului au avut loc pe Axio Imager Z1 (Zeiss, Jena, Germania) și software-ul Isis (versiunea 5.3.1, MetaSystems, Altlussheim, Germania). Pentru a evalua numărul de copii ale fiecărei probe individuale, au fost numărate semnalele specifice genei și centromerilor din 20 de nuclee de celule tumorale care nu se suprapun. Acum semnalele specifice genei au fost comparate cu semnalele specifice centromerului (numărul de copii ale genei: numărul de copii ale cromozomilor). Amplificarea a fost un coeficient> 2,2 și un coeficient de 50%. 50
Figura 4-6 Rezumatul analizei mutațiilor IDH-1 și IDH-2 cu exemple reprezentative de mutații în genele IDH-1 și IDH-2. 54