Jurnal de laborator - Prezentare generală a produselor - Kituri de purificare a anticorpilor
În laboratoarele academice de cercetare, anticorpii sunt adesea purificați folosind coloane de afinitate. Foto: Universitatea din Florida
(01.09.2020) Kituri de purificare a anticorpilor se bazează în cea mai mare parte pe coloane mici de rotire sau margele care sunt echipate cu proteine A sau G. Un grup israelian a dezvoltat o alternativă interesantă fără cromatografie.
Ce ar fi cercetarea modernă a științelor vieții fără anticorpi policlonali (pAb) sau monoclonali (mAb)? Nu ar mai rămâne prea mult dacă ignorați omniprezenta PCR. Nu există cu greu un experiment sau test în care micii ajutor să nu fie implicați și să le facă viața mai ușoară cercetătorilor sau să le permită experimentele în primul rând. Anticorpii nu sunt indispensabili numai în cercetarea de bază pentru nenumărate metode și protocoale, de la imunoanalize, Western blot, ELISA și imunohistochimie la microscopie și imagistică la citometrie în flux. Ele sunt, de asemenea, instrumente importante în diagnosticul clinic și sunt utilizate din ce în ce mai mult ca ingrediente active sau anticorpi terapeutici pentru tratamentul diferitelor boli.
Una dintre cele mai importante surse de anticorpi policlonali sau imunoglobuline (Ig) este plasma sanguină a mamiferelor. Pe baza greutății, aproximativ douăzeci la sută din proteinele pe care le conține sunt anticorpi care sunt împărțiți în cinci clase diferite: IgA, IgD, IgE, IgG și IgM. Primele trei joacă, de asemenea, roluri importante în cadrul sistemului imunitar, dar IgG-urile și IgM-urile sunt utilizate în principal în scopuri de cercetare. IgM apar în faza incipientă a răspunsului imun primar la un antigen, în timp ce IgG sunt sintetizate în cantități mari în răspunsul imun secundar ulterior.
Cercetătorii profită de acest lucru prin injectarea unui antigen în iepuri, capre, oi sau alte mamifere și apoi izolarea și purificarea de obicei a IgG-urilor formate în timpul răspunsului imun din plasma sau antiserul animalelor. În epoca pre-kit, au precipitat mai întâi proteinele plasmatice cu sulfat de amoniu, pe care le-au adăugat până la o concentrație finală de 25%. După centrifugare și îndepărtarea proteinelor, a venit rândul IgG-urilor, care au fost precipitate cu cincizeci la sută sulfat de amoniu.
Cele două etape de precipitare și dializa ulterioară a soluției de anticorp obținute pentru a scăpa de sulfatul de amoniu necesită totuși o mulțime de muncă manuală și durează câteva zile. IgG-urile pot fi izolate mult mai repede și mai ușor cu kituri de purificare a anticorpilor, care se bazează aproape în întregime pe coloane de mici afinități sau margele care sunt echipate cu proteina A sau proteina G. Originar din Staphylococcus aureus (Proteina A) și Streptococcus sp. Proteinele de suprafață derivate din (proteina G) se leagă cu specificitate ridicată la partea Fc a multor IgG.
În timp ce proteina G are o afinitate ridicată pentru majoritatea IgG-urilor, proteina A este puțin mai pretențioasă și este cu greu atrasă de IgG-uri de la hamsteri, șobolani sau oi, de exemplu. Pentru purificarea afinității, variantele exprimate recombinant de proteine A și G sunt atașate la rășinile cromatografice fie separat, fie uneori în combinație, sau legate de materialul de suprafață al granulelor magnetice. Adesea, o singură etapă de cromatografie este suficientă pentru a obține purități ale anticorpilor izolați de peste 98%.
În laboratoarele de cercetare, IgM-urile semnificativ mai instabile, care tind să se agregeze, sunt deseori curățate cu coloane de afinitate. Matricea de legare utilizată aici nu este proteina A sau G, ci proteina de legare la manoză sau lectina de legare la manoză (MBL), care este în mare parte imobilizată pe agaroză.
Pentru purificarea la scară mai mare, proteinele A și G sau alți liganzi specifici pentru cromatografia de afinitate sunt destul de costisitoare. Prin urmare, producătorii de anticorpi și laboratoarele farmaceutice trec la cromatografia clasică cu schimb de ioni și umple coloanele cu schimbătoare de anioni mult mai ieftine, cum ar fi dietilaminoetil (DEAE) agaroză, pentru a obține IgG curate, IgM și, în special, anticorpi monoclonali (mAb). Dar aceste tehnici trebuie să lupte și cu dezavantajele generale ale metodelor de purificare cromatografică - cum ar fi capacități de legare limitate, cheltuieli mari de timp și întreținere costisitoare a dispozitivelor.
Din acest motiv, unele grupuri lucrează persistent la alternative la procesele cromatografice, urmând sloganul care se aude din ce în ce mai des: Anything except Chromatography (ABC). Unul dintre aceste concepte de purificare fără anticromatografie pentru anticorpi a fost prezentat anul trecut de grupul lui Guy Patchornik de la Universitatea Ariel din Israel, împreună cu colegii din India (MABS 11 (3): 583-92). Deoarece anticorpii pot fi purificați și cu cromatografie de interacțiune hidrofobă (HIC), Patchornik a presupus că anticorpii se leagă puțin mai puternic de rășinile hidrofobe decât alte proteine solubile în apă. Deci, conform ideii sale, ar trebui să fie captate și cu agregate de detergent hidrofob.
Angajații Patchornik au generat agregatele prin adăugarea mai întâi a hidrofobului chelator batofenantrolină (Batho) într-o soluție apoasă de Tween-20 și prin amestecarea cu vortex. Acest lucru le-a dat Tween 20 de micele, ale căror suprafețe au fost decorate cu partea hidrofobă a moleculelor Batho. Apoi au amestecat aceste micelele proiectate cu o soluție de sulfat de fier și au agitat din nou. Reacția ulterioară a continuat practic în mod automat: Ionii Fe 2+ formează complexe hidrofobe (Batho) 3: Fe 2+ cu moleculele Batho poziționate la limita de fază dintre micelii și apă, ceea ce duce la o reticulare a micelelor pentru a forma Tween hidrofob. -20 unități de plumb.
Israelienii au testat dacă agregatele erau adecvate pentru purificarea anticorpilor folosind un amestec de IgG policlonale umane care conțin lizat de E. coli ca o contaminare artificială. Procedura de curățare pe care au folosit-o pentru aceasta este foarte simplă: amestecul de anticorpi este incubat timp de cinci minute cu agregatele Tween-20 prefabricate și apoi centrifugat timp de două minute. IgG-urile pot fi apoi izolate din agregate în câteva minute folosind o soluție de izoleucină de 50 milimolari (pH 3,8). Întregul lucru funcționează și în mediu hibridom fără ser, care este de obicei utilizat pentru producerea de anticorpi monoclonali - precum și în prezența albuminei serice bovine (BSA), care se găsește adesea în mediul de cultură celulară pentru producerea de anticorpi.
Deoarece atât puritatea IgG-urilor izolate cu agregatele Tween 20, cât și randamentul sunt doar marginal mai slabe decât în cazul cromatografiei de afinitate cu proteina A, Patchornik este convins că metoda sa este o alternativă reală la purificarea convențională. El ar putea chiar să-l imagineze înlocuind pilonii Proteinei A în purificarea anticorpilor terapeutici.
Grupul Ana Cecília A. Roques de la Universitatea Nova din Lisabona ocolește purificarea cromatografică a anticorpilor cu o combinație de ligand de afinitate, precipitații și nanoparticule magnetice (Biotechnol. J. DOI: 10.1002/biot.202000151).
Cele trei tehnici individuale nu sunt desigur noi. Ceea ce este nou, totuși, este fuzionarea lor pentru a forma ceea ce este cunoscut sub numele de precipitații magnetice de afinitate. Practic, acest lucru este extrem de simplu - cel mai complicat pas este producerea de nanoparticule magnetice care sunt echipate cu un ligand triazinic care se leagă în mod specific de anticorpi.
Particulele sunt apoi amestecate cu 20% PEG3350, care servește ca precipitant. Extractul brut este incubat cu amestecul timp de o oră la 4 ° C și agitat pe un agitator orbital. Se aplică apoi un câmp magnetic timp de cincisprezece minute pentru a separa particulele magnetice precipitate cu anticorpii aderați la aceștia de supernatant. Anticorpii sunt apoi îndepărtați ușor din nanoparticule cu o soluție neutră de PBS.
Folosind metoda, echipa lui Roque a izolat anticorpi policlonali din serul uman cu un randament de 50% și o puritate de 80%. Portughezii au obținut valori și mai bune în purificarea anticorpilor monoclonali.
(Prima publicație: H. Zähringer, Jurnal de laborator 9/2020, începând cu august 2020, toate informațiile fără garanție)
Ultimele modificări: 01.01.2020
© 1996-2020 Conținut editorial: LJ-Verlag GmbH & Co. KG, Freiburg, proiectare și programare: agenție de internet f + r, Freiburg,
Fotografii și grafică - cu excepția cazului în care se indică altfel - cu autorii și fotografii respectivi.