Laborjournal online Journalclub - bacterii pe o cale greșită
Sigrid March
Ilustr.: IStock/Natallia Yatskova; editat de JM
(12.10.2020) LEIPZIG: Persoanele cu obezitate suferă uneori de tulburări metabolice și diabet de tip 2. Cercetătorii au arătat că la acești pacienți, mai multe bacterii din intestine pătrund în țesutul gras din jur și declanșează reacții inflamatorii acolo: cu cât au găsit mai multe bacterii, cu atât sunt mai mari valorile inflamației și pacienții sunt mai bolnavi.
Mai mult de jumătate dintre adulții din Germania sunt supraponderali, deci au un indice de masă corporală (IMC) de peste 25 kg/m 2; aproximativ 16% sunt foarte supraponderali (obezi; IMC mai mare de 30 kg/m2). Obezitatea este dăunătoare pentru sănătate, în funcție de locul în care se acumulează grăsimea. În special, așa-numita grăsime viscerală, care înconjoară organele interne din abdomen și le protejează de influențele mecanice, tinde să se extindă atunci când există o surplus de hrană. Cu toate acestea, această grăsime viscerală nu este doar întinsă, ci secretă și o varietate de hormoni și adipokine. Acestea includ, de exemplu, citokine cum ar fi interleukina-6 (IL-6) și factorul de necroză tumorală (TNF) -α sau hormonul peptidic adiponectin, un modulator al insulinei. Este de înțeles că prea multă grăsime viscerală poate aduce metabolismul uman în dezechilibru.
Obezitatea viscerală este un factor de risc bine cunoscut pentru numeroase boli, de exemplu arterioscleroza, cancerul sau diabetul de tip 2. Aproximativ șapte milioane de persoane din Germania trăiesc cu diabet zaharat. Mai mult de 95% dintre bolnavi prezintă tipul 2, o rezistență la insulină care apare adesea treptat la bătrânețe. Pancreasul continuă inițial să producă suficientă insulină - spre deosebire de diabetul de tip 1 -, dar nu mai este absorbit de organul țintă. Acest lucru duce la o creștere permanentă a nivelului de zahăr din sânge, care, la rândul său, favorizează deteriorarea organelor și complicații precum accidentul vascular cerebral și atacul de cord Cei mai importanți factori de risc pentru diabetul de tip 2, pe lângă predispoziția genetică și prea puțină mișcare, sunt supraponderali. 90% dintre pacienți sunt supraponderali, un sfert chiar obezi.
Dar de ce unii obezi se îmbolnăvesc foarte mult din punct de vedere metabolic, iar alții nu? Aceasta este întrebarea adresată de cercetătorii de la Clinica și Policlinica pentru Endocrinologie, Nefrologie și Reumatologie de la Spitalul Universitar din Leipzig, mai precis directorul studiului Peter Kovacs. Este profesor de genetică a obezității și diabetului la Centrul integrat de cercetare și tratament pentru bolile obezității. După ce a studiat farmacie în Slovacia, Kovacs a venit la Greifswald, unde și-a luat doctoratul în genetică a diabetului de tip 2 în 1998. După ani postdoctorali la National Institutes of Health din Phoenix (Arizona), a ajuns la Leipzig. Acolo l-a întâlnit pe medicul Rima Chakaroun. Endocrinologul a lucrat la adipokine în timpul tezei sale de doctorat și ulterior a inițiat un studiu privind efectul microbiomului intestinal asupra obezității și a bolilor metabolice.
Sună ca o combinație optimă pentru a privi legătura dintre obezitate și diabetul de tip 2. Cercetătorii au găsit deosebit de nedumeritor faptul că au fost observate procese inflamatorii în țesutul gras al multor persoane obeze. „Ca parte a unei diete bogate în grăsimi, alți cercetători au hrănit șoarecii cu alimente care conțineau bacterii marcate cu fluorescență. Ulterior au găsit fragmente ale acestor bacterii în țesutul adipos ”, relatează Chakaroun. Au fost bacteriile care au provocat simptomele inflamației? „Așa că am început să căutăm bacterii în țesutul adipos uman”, spune Kovacs. Rezultatul a fost o publicație în Gut, cu Chakaroun și (pe atunci încă) doctorandul Lucas Massier ca primii autori (69: 1796-806).
Pentru studiu, cercetătorii de la Leipzig au recrutat 75 de pacienți (IMC în medie 48 kg/m2) care au fost supuși unei intervenții chirurgicale bariatrice. Operația de by-pass gastric Roux-en-Y este un tip de reducere a stomacului și scurtarea intestinului subțire. Deci mâncarea ia autostrada de ocolire prin tractul digestiv. Acest lucru ar trebui să îi ajute pe oameni să reducă greutatea, printre altele, deoarece mâncarea nu este complet absorbită. 33 dintre persoanele testate au fost, de asemenea, pacienți cu diabet zaharat de tip 2, cu parametri inflamatori semnificativ crescuți și valori anormale ale metabolismului glucozei în sânge.
În timpul procedurii, chirurgii au prelevat probe de grăsime subcutanată și viscerală - cât mai sterile posibil - din diferite locații, cum ar fi omentul (o structură asemănătoare rețelei pe peritoneu) sau mezenterul (o parte a suspensiei intestinale). Din aceste probe de țesut, Massier, Chakaroun și colegii au izolat ADN și ARN și au produs secțiuni de țesut.
De fapt, cercetătorii au descoperit ADN bacterian în țesutul adipos, deși în cantități neglijabile. Doar 0,1 până la 0,5 picograme pe microgramă de ADN total nu provin de la oameni, ci de la bacterii. În timpul secvențierii genei bacteriene ARNr 16S în probele de țesut, au găsit apoi un număr mare de urme. Unii ar putea fi excluși ca contaminare cu ajutorul algoritmilor bioinformatici, dar pacienții cu sau fără diabet au diferit în 18 specii bacteriene. Cercetătorii au numit acest fenomen o semnătură bacteriană taxonomică specifică țesutului, care s-a corelat și cu apariția markerilor inflamatori și a parametrilor metabolici.
Peter Kovacs, Rima Chakaroun și Lucas Massier au rezolvat misterul de ce țesutul adipos al multor persoane obeze este inflamat. Foto: Universitätsmedizin Leipzig (stânga); Privat (mijloc și dreapta)
Ambele grupuri de pacienți au prezentat, de asemenea, bacterii ale tulpinilor Proteobacteria și Firmicutes în țesutul adipos și sistemic. În special, se știe că bacteriile firului firicute apar mai frecvent decât media în microbiomul intestinal al persoanelor obeze. „Știm că anumite bacterii din microbiomul intestinal promovează creșterea în greutate și că compoziția microbiomului depinde atât de gene, cât și de stilul nostru de viață”, spune Chakaroun. Prin urmare, cercetătorii nu au fost surprinși să găsească aceste tulpini de bacterii. Rezultatele nu au putut răspunde dacă microbii migrează efectiv prin peretele intestinal în țesutul înconjurător sau dacă sunt absorbiți pasiv - ca resturi celulare, ca să spunem așa.
De aceea, nu a fost suficient ca cercetătorii de la Leipzig să caute în țesutul adipos uman fragmente de ADN bacterian. Au vrut să arate că există de fapt bacterii intacte în abdomen în afara intestinului. Pentru a face acest lucru, au recurs la o metodă care este de fapt utilizată în analiza mediului. „CARD-FISH este semnificativ mai sensibil decât FISH singur și am sperat să putem detecta cantități mici de bacterii din țesutul adipos”, spune Kovacs, iar Chakaroun adaugă: „Deoarece nu suntem experți în microbi, avem aceste teste împreună realizat cu Niculina Musat de la Centrul de Cercetări pentru Mediu (UFZ) aici, în Leipzig. "
Ce este CARD-FISH? Cunoaștem FISH ca fluorescență hibridizare in situ, adică o metodă de hibridizare în care sondele de nucleotide marcate cu fluorescență sunt utilizate pentru a pescui ADN sau ARN complementar pe secțiuni de țesut, de exemplu. În multe eșantioane de mediu există nu numai mici grupuri de bacterii, ci sunt bine distribuite și în orice cantitate de murdărie. Aceasta înseamnă că semnalele de fundal sunt adesea semnificativ mai mari decât semnalul de fluorescență real de la sondă. Pentru a rezolva acest lucru, FISH este acum alăturat de CARD, Catalysed Reporter Deposition: O secțiune clasică de țesut pentru imunohistochimie este hibridizată cu o sondă ADN monocatenară împotriva eubacteriilor. Această sondă nu poartă fluorofor, ci enzima HRP (Hreanul Peroxidază). În prezența peroxidului de hidrogen, peroxidaza transformă tiramidele inactive, marcate cu fluorescență, în radicali tiramidici. La rândul lor, acestea se leagă covalent de lanțurile laterale aromatice - de exemplu de tirozină - ale proteinelor din vecinătatea directă a HRP. Deoarece acest proces este enzimatic, multe tiramide sunt „radicalizate” în timp.
În loc de un fluorofor pe sondă, cercetătorul primește până la 1.000 de semnale fluorescente cu amplificarea semnalului tiramidic (TSA). În acest fel, chiar și cele mai mici urme de material bacterian atrag atenția. Cu CARD-FISH, bacteriile pot fi detectate și cuantificate fără a fi nevoie să le îndepărtați sau să le îmbogățiți în prealabil. Și exact asta au realizat cercetătorii de la Leipzig - au găsit bacterii intacte în țesutul adipos uman. De asemenea, au arătat că cu cât sunt mai multe bacterii în țesutul adipos, cu atât sunt mai mari nivelurile de inflamație și pacienții sunt mai bolnavi. Concluzia pe care Chakaroun și Kovacs o trag din aceste rezultate: cantitatea și compoziția bacteriilor din țesutul adipos contribuie, de asemenea, la inflamația la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 și la persoanele supraponderale.
Nu este clar cum ajung bacteriile în grăsimea viscerală. „Intestinul este una dintre cele mai mari interfețe cu mediul nostru”, spune Chakaroun. „Se știe că anumite obiceiuri alimentare sau consumul de alcool influențează permeabilitatea intestinală.” În plus, unele bacterii - de exemplu Enterobacteriaceae - produc lipopolizaharide toxice, care fac și peretele intestinal mai permeabil. În acest fel, bacteriile din flora intestinală ar putea migra cu ușurință în țesutul înconjurător sau ar putea fi spălate. „Într-un proiect următor, vom măsura permeabilitatea intestinală a pacienților, astfel încât să putem dovedi și acest punct”, spune Kovacs.
Dar sunt câteva bacterii din țesutul adipos cu adevărat suficiente pentru a declanșa o reacție imună și a îmbolnăvi oamenii? În cele din urmă, cercetătorii au calculat că cantitatea mică de ADN bacterian din țesutul adipos este aproximativ echivalentă cu o bacterie pentru fiecare 100 de adipocite. Prin urmare, în modelul culturii celulare, aceștia au enervat adipocitele cu o cantitate comparabilă de ADN bacterian. Și iată - celulele au reacționat cu o furtună de indignare și - în funcție de concentrație - au eliberat markerii inflamatori IL-6 și TNFα.
Cercetătorii de la Leipzig intenționează să analizeze mai multe probe de țesut în viitor. „Vrem să creăm un fel de biobancă pentru acest proiect, în care, desigur, sunt stocate controalele organelor pentru subiecții sănătoși și cu greutate normală”, spune Kovacs. Până în prezent acest lucru a eșuat din cauza preocupărilor etice. Dar există discuții cu clinica cu privire la modalitățile prin care va fi posibilă accesarea țesutului sănătos.
Cu toate acestea, co-primul autor al studiului Lucas Massier nu va mai participa la experimentele de continuare pentru moment. „Acest studiu i-a mărit valoarea de piață, așa că a fost recrutat la Institutul Karolinska din Stockholm înainte de a-și apăra teza de doctorat”, spune Kovacs. Dar chiar și acolo continuă să lucreze la biologia țesutului adipos.
Ultimele modificări: 10/12/2020