Metoda fără purificare de proteine ​​pentru determinarea afinității de legare prin termoforeză la scară microscopică

rezumat

Termoforeza la microscală (MST) poate fi utilizată pe scară largă pentru determinarea afinității de legare fără purificarea proteinei țintă din lizatele celulare. Protocolul implică supraexprimarea proteinei condensate GFP, liza celulelor în condiții care nu denaturează și detectarea semnalelor HNR în prezența concentrațiilor variate ale ligandului.

Abstract

Caracterizarea cantitativă a interacțiunilor proteice este esențială în practic toate domeniile științelor vieții, în special descoperirea medicamentelor. Cele mai multe metode disponibile în prezent pentru determinarea K D necesită acces la proteina de interes, a cărei producție poate fi consumatoare de timp și costisitoare de purificat. Am dezvoltat un protocol care permite determinarea afinității de legare prin termoforeză microscopică (MST) fără purificarea proteinei țintă din lizatele celulare. Metoda implică supraexprimarea proteinei condensate GFP și liza celulelor în condiții care nu denaturează. Aplicarea metodei STAT3-GFP exprimată tranzitoriu în celulele HEK293 a făcut posibilă determinarea pentru prima dată a afinității factorului de transcripție bine studiat pentru oligonucleotide cu secvențe diferite. Protocolul este simplu și poate avea o varietate de aplicații pentru studiul interacțiunilor proteice cu molecule mici, peptide, ADN, ARN și proteine.

Introducere

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Prepararea lizatului celular

Acest protocol este destinat celulelor aderente care exprimă o proteină GFP condensată. Numărul de celule necesare poate varia de la un minim de 10 6 la mai puțin de 20 x 106 celule, în funcție de nivelul de exprimare a proteinelor. De exemplu, lizatul celular HEK supraexprimând GFP-STAT3 a fost preparat prin tratarea celulelor crescute în 10 baloane T75 până la confluența de aproape 70% cu 1 ml tampon de liză. Cu toate acestea, acest lizat a trebuit să fie diluat de 150 de ori pentru a oferi un nivel optim de fluorescență pentru experimentul MST. Protocolul de liza celulară depinde puternic de proprietățile și localizarea intracelulară a proteinei studiate. Dacă nu este de dorit utilizarea detergenților din cauza instabilității proteinelor, ultrasunetele descrise mai jos ar putea fi cea mai bună alegere. Diferenți aditivi pot fi adăugați în tamponul de liză pentru a evita reacțiile de modificare a proteinelor: EDTA previne fosforilarea, vanadatul de sodiu inhibă fosfatazele proteice ale tirozinei, deci fluorura de sodiu este un inhibitor al fosfatazelor Ser/Thr.

2. Selectarea și pregătirea bufferului MST

  1. Deoarece interacțiunile proteină-ligand sunt dependente de condițiile de tamponare, compoziția tamponului MST este aleasă pe baza proprietăților unui anumit sistem. În general, este benefic să testați cel puțin două tampoane diferite.
  2. Pregătiți 2 tampoane MST 5x. Am avut experiențe bune cu aceste două compoziții: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) și Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl; 50 mM MgCl2, 0,05% Tween-20). Adăugarea de BSA (5% în amestecul final de liant) poate ajuta la prevenirea aderenței proteinelor la tuburile de plastic și capilarele de sticlă. NaN3 (0,5 mM) poate fi, de asemenea, de așteptat să prevină creșterea microorganismelor.

3. Determinarea diluției optime de lizat

  1. Selectați sursa de excitație LED cu lungimea de undă λ = 470 nm pe instrumentul MST.
  2. Încărcați capilarele cu extract ECll diluat 2 și 10x cu tampon MST.
  3. Efectuați operația „Găsiți capilare” pe software-ul MST Instrument Control. Intervalul de fluorescență optim în lizatul diluat este de 400 până la 1500 de unități de fluorescență.

4. Determinarea domeniului optim de concentrație a ligandului

  1. Cea mai mare concentrație de ligand trebuie să fie de cel puțin 20 de ori mai mare decât constanta de disociere așteptată.
  2. Concentrația mai mică a ligandului trebuie să fie mai mică decât concentrația molară a proteinei fluorescente.

Consultați instrumentul de căutare NanoTemper Concentration Technologies pentru estimarea intervalului de concentrație a ligandilor.

5. Pregătirea lizatului celular și a diluțiilor liganzilor

  1. Așezați un suport pentru tuburi cu un număr necesar (de obicei 10-16) de 0,5 ml tuburi de centrifugă LoBind pe gheață. Pipetați 25 pl de tampon MST în partea de jos a fiecărui tub. Adăugați 25 pl din soluția stoc de ligand la prima cadă (numărul 1, ligand cu concentrație mai mare) și efectuați în serie diluarea ligandului de două ori folosind restul tuburilor. Păstrați raftul cu probe de ligand pe gheață.
  2. celula dezghețată se lizează lent pe gheață.
  3. Diluați lizatul celular cu tampon MST pentru a furniza nivelul optim de proteină țintă fluorescentă în reacțiile de legare. Concentrația finală de proteine ​​ar trebui să fie aproape predusă KD sau mai mică. Trebuie ajustat pentru a obține numărul necesar de fluorescențe în soluția finală. Pentru determinarea concentrației GFP-STAT3 în lizat, instrumentul a fost calibrat cu ajutorul fluoresceinei. Concentrația molară de GFP în lizat a fost determinată utilizând raportul dintre fluoresceină și, respectiv, EGFP, randamente cuantice, 0,85 și 0,61.