Modificări evolutive în utilizarea aminoacizilor redox-activi și cauzele acestora - PDF gratuit

Modificări evolutive în utilizarea aminoacizilor redox-activi și cauzele acestora Variabilitate evolutivă în utilizarea aminoacizilor activi redox: cauze și consecințe D i s s e r t a t i o n pentru obținerea diplomei de doctor în științe naturale la Facultatea de biologie de la Universitatea Johannes Gutenberg Mainz prezentată de Mario Schindeldecker geb. la 20 decembrie 1978 în Rodalben a.d. Rodalb Mainz, 2014

Decan: 1 recenzor: 2 recenzor: Ziua examenului oral: 03.06.2015

Cuprins Lista abrevierilor. IV 1 Introducere. 1 1.1 Stresul oxidativ. 1 1.2 Mitocondriile. 1 1.2.1 Structură și funcție. 2 1.2.2 Lanțul respirator mitocondrial și fosforilarea oxidativă. 4 1.2.3 Abateri de la codul genetic universal. 11 1.3 Teoria radicalilor liberi a îmbătrânirii. 12 1.3.1 Specii reactive de oxigen. 12 1.3.2 Teoria mitocondrială a radicalilor liberi a îmbătrânirii. 14 2 Probleme și obiective. 17 3 material. 18 3.1 Înregistrări de date proteice. 18 3.1.1 Durata de viață, masa corporală și secvențele proteice ale speciilor de animale examinate. 18 3.1.2 Secvențe de proteine umane ale compartimentelor individuale. 20 3.1.3 Subunități nucleare și codificate mitocondrial ale complexelor lanțului respirator. 21 3.2 Programe de calculator și pachete software. 21 3.3 Produse chimice speciale. 21 3.4 Lista dispozitivelor. 22 3.5 Cultura celulară. 23 3.5.1 Celule clonale. 23 3.5.2 Celule primare. 23 3.6 Medii și soluții pentru cultura celulară. 23 3.7 Soluții pentru teste biochimice și biologice celulare. 24 3.8 Tampoane și soluții pentru analiza proteinelor și lipidelor. 24 3.9 Anticorpi. 27 4 Metode. 29 4.1 Analize bioinformatice. 29 4.1.1 Frecvența utilizării aminoacizilor în secvențe de proteine. 29 4.1.2 Identificarea zonelor de membrană. 29 4.2 Cultura celulară. 29 4.2.1 Determinarea vârstei celulare a celulelor IMR90. 29 I.

Lista de abrevieri 2SH mercaptoetanol 4SH 1-butantiol 8SH 1-octantiol 10SH 1-decanethiol 12SH 14SH 1-dodecantiol 1-tetradecanethiol 18SH 1-octadecanethiol ABAM mix antibiotic antifungic mix ammonate amoniacal, AChE acetilcolinesterazei AA catalanethiol, AChE, acetilcolinesteraza AA, AChE, acetilcolina trifazata, AChE, acetilcolina trifazata, AChE, acetilcolina trifazata, AChE, acetilcolina trifazata, AChE, catalosulphase, AChE, catalosulphase, AChE, acetilcolina trifazata, AChE, catalosulphase, AChE, trifazata aacetylcholine, AChE, un catalosulphase, o. catalaza CYS cisteină ddH2O dublu distilată apă de mediu Eagle modificat ADN-3-acid mercaptopropionic DHA docosahexaenoic Acid DMEM Dulbecco dimetilsulfoxid DMS Dodecylmethylsulfid DMSO dezoxiribonucleic DOH Acid 1-dodecanol fosfat DPBS Dulbecco Buffered Saline CstF factor de stimulare clivaj DTT ditiotreitol EDTA ER etilendiaminotetraacetic reticulul endoplasmic inel de transfer ETF electroni flavoproteina EtOH etanol Ser fetal bovin/vițel FBS/FCS, ser fetal bovin FMN flavină mononucleotidă GRază glutation reductază IV

GSH glutation GPX glutation peroxidază h ore, ore H2O2 peroxid de hidrogen HRP peroxidază de hrean, peroxidază de hrean MAM membrană ER asociată mitocondriilor MEM NEAA Mediu minim esențial, aminoacizi neesențiali MTS secvență de direcționare mitocondrială M minute min minute (s) mtdna Acid dezoxiribonucleic mitocondrial Msr metionină sulfoxid reductază MTT 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2,5-difeniltetrazolium bromură MUFA (acizi) acizi grași mononesaturați, acizi grași mononesaturați miligrame mg miligrame NADPH nicotinamidă adenină dinucleotid fosfat NOX NADPH oxidază NaN3 azidă de sodiu nm nanometru Oxa1 mitocondrial oxidază asamblare proteină 1 PAGINĂ poliacrilamidă gel electroforeză PD dublare populație PUFA (uri) acid (e) polinesaturat (e) acid ribonucleic acid ribonucleic ribonucleic specii reactive de oxigen, Sa reactive ustoffspies SDS sodiu dodecil sulfat, sodiu dodecil sulfat SOD superoxid dismutază SRP recunoaștere semnal particule V

t12sh terț-dodecanetiol TBARS substanțe reactive ale acidului tiobarbituric, substanțe reactive ale acidului tiobarbituric TEMED N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamină TFA acizi grași trans, acizi grași trans TM transmembranari TOC α-tocoferol, vitamina E TOM translocază a membranei exterioare Tioredoxină TWEEN polisorbat VDAC canal anion dependent de tensiune VI

Introducere Figura 5: Prezentare generală a reacțiilor speciilor reactive de oxigen și a speciilor nitro în mitocondrie și a consecințelor sale. Adaptat de la Smith și colab., 2003. Toxicitatea superoxidului în matricea mitocondrială poate fi studiată la șoareci knockout Mn-SOD mitocondriali, care au supraviețuit doar între 10 și 20 de zile chiar și în prezența antioxidanților (Lebovitz și colab., 1996; Li și colab., 1995). În schimb, o eliminare a Cu/Zn-SOD citosolică nu este letală, deși aceste animale prezintă o sensibilitate ușor crescută la ROS (Ho și colab., 1998), ceea ce sugerează că superoxidul extramitocondrial este mai puțin toxic. O caracteristică a acumulării pe tot parcursul vieții a proteinelor și lipidelor deteriorate de oxidare este apariția strict lipofuscină dependentă de vârstă, stocarea nedegradabilă a proteinelor lipofile, agregate (30-58%) și lipidelor (1951%) în celulele postmitotice (Porta, 2002). Lipofuscina apare deosebit de puternic în mușchii inimii și celulele nervoase, precum și în epiteliul pigmentar retinian. Pe scurt, cursul progresiv al îmbătrânirii poate fi explicat prin intermediul acestei teorii după cum urmează: În cursul îmbătrânirii, proteinele oxidate se acumulează constant. Oxidarea a 16

Material 5 ml piruvat (100 mm) 5 ml MEM NEAA (100 mm) 3.7 Soluții pentru teste biochimice și biologice celulare Soluție MTT (soluție de bromură de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2,5-difeniltetrazoliu: 5 mg/ml MTT în soluție de solubilizare ddh2o MTT: 40% (g/v) dimetilformamidă 10% (g/v) dodecil sulfat de sodiu pH 4,0 (acid acetic glacial) 3,8 tampoane și soluții pentru analiza proteinelor sau lipidelor 10x soluție salină tamponată cu fosfat (PBS): 1,37 M NaCl 27 mm KCl 100 mm Na2HPO4 x H2O 18 mm KH2PO4 ph 7.4 Soluție salină tamponată cu fosfat cu TWEEN-20 (PBS-T): 1x PBS 0,05% (v/v) TWEEN-20 ph 7.4 Tampon de recoltare a celulei (tampon de liză) fără SDS: 24

Material 50 mm Tris-HCl 10% zaharoză 1 mm EDTA 1 mm EGTA 15 mm HEPES 1 mm sodiu ortovanadat 1 mm inhibitor NaF proteinază 1: 100 (Sigma-Aldrich) inhibitor fosfatază 1: 100 (Sigma-Aldrich) ph 6,8 4x tampon de încărcare (Tampon de probă) pentru SDS-PAGE: 200 mm Tris-HCI, ph 6,8 8% (g/v) SDS 40% (g/v) glicerol 0,02% (g/v) albastru de bromofenol 20% (v/v) β-mercaptoetanol 10x tampon de funcționare pentru SDS-PAGE: 250 mm Tris bază 2,5 M glicină 1% (g/v) SDS pH 8,3 gel de separare pentru SDS-PAGE: 0,375 M Tris-HCI, pH 8, 8 10% (g/v) acrilamidă/bisacrilamidă (29: 1) 0,1% (g/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 25

Material 0,1% (g/v) gel de stivuire APS pentru SDS-PAGE: 0,15 M Tris-HCI, pH 6,8 3% (g/v) acrilamidă/bisacrilamidă (29: 1) 0,1% ( g/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 0,1% (g/v) APS 10x tampon de transfer: 250 mm Tris bază 2,5 M glicină Adăugare de 20% metanol la 1x diluție 1x Ponceau S.: 0,2% (g/v) Ponceau S 5% (v/v) tampon de blocare a acidului acetic: 5% (g/v) lapte praf uscat (fără grăsimi) în PBS-T tampon lipidic nereducător (degazat): 20 mm TRIS, ph 7,4 1 mm MgCl2 5 mm KCl 26

Tampon material pentru analiza acizilor grași: 1x PBS 10 µm fenotiazină 1 mm DTT 1 mm EDTA Soluții de dezvoltator de luminol: A: 0,1 M Tris-HCI, pH 8,6 0,025% luminol B: 0,11% acid para-cumaric în DMSO C: Test 30% H2O2 TBARS Soluție stop: 5% acid tricloracetic în acid acetic glacial 1 M acid 0,5% tiobarbituric în 10 mm NaOH 3,9 Anticorpi Anticorpii utilizați au fost diluați în PBS-T la concentrațiile date mai jos. În plus, la anticorpii primari s-a adăugat 0,05% azidă de sodiu (NaN3). Producător de anticorpi anti-hsp70 (1: 1000) genă de stres, SUA anti-hsp90 (1: 1000) genă de stres, SUA anti-p21 (1: 500) BD Biosciences, SUA anti-p53 (1: 1000) Abcam, SUA anti-p62 (1: 500) Santa Cruz Biotechnology, SUA anti-poliubiquitin (1: 1000) Dako, Danemarca anti-tubulin (1: 1000) Sigma-Aldrich, Germania Tabelul 6: Anticorpi primari 27

Producător de anticorpi material Esel anti-mouse-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, SUA Esel anti-rabbit-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, SUA Tabelul 7: Conjugați anticorp secundar-HRP 28

Rezultate Figura 7: Rapoarte de distribuție a aminoacizilor între proteinele peroxizomale și celulare la 4 specii (de la stânga la dreapta: Homo sapiens, Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus). 5.1.2 Compararea proteinelor mitocondriale și celulare Raportul utilizării aminoacizilor în proteinele codificate mitocondriale comparativ cu proteinele celulare sau proteinele codificate mitocondriale în comparație cu proteinele localizate mitocondriale a fost utilizat ca modelele doi și trei (Figura 8 și Figura 9). Unele particularități ale mitocondriei sunt că este considerat a fi principalul loc de producție pentru speciile de oxigen oxidativ (Brand, 2010) și că în proteinele codificate mitocondriale din complexul I aminoacidul redox-activ cisteină este epuizat în funcție de durata de viață (Schindeldecker și colab., 2011), în timp ce Metionina activă redox este, de asemenea, îmbogățită acolo, indiferent de durata maximă de viață (Bender și colab., 2008). Acest lucru face din mitocondrie un model proeminent pe care pot fi studiate adaptările evolutive la stresul oxidativ și frecvența diferențiată de utilizare a aminoacizilor rezultată. 39

Rezultate Utilizați KLMNPQRSTVWY Aerobicitate (V) 1,39 1,01 1,51 1,16 1,63 1,77 1,04 0,93 1,68 0,58 1,03 0,68 5E-05 6E-01 2E -06 1E-02 5E-09 9E-12 2E-01 5E-05 1E-09 3E-12 6E-01 2E-11 Tabelul 12: Modelul V: Frecvența utilizării aminoacizilor în proteinele din lanțul respirator codificate mitocondriale în viața liberă, aerobă versus parazită, helmintii anaerobi. (o singură direcție, analiza non-parametrică a varianței cu două categorii). * Termenul rație descrie raportul valorilor medii. Dacă se compară utilizarea diferențiată a aminoacizilor în proteinele codate mitocondrial ale lanțului respirator între viermii aerobi și anaerobi, se observă că cisteina prezintă cea mai mare schimbare medie sub formă de epuizare (Tabelul 12). Cu toate acestea, cea mai mare semnificație este prezentată de histidină, care se datorează, prin urmare, dispersiei reduse a punctelor de date. Frecvența utilizării metioninei, pe de altă parte, arată o dispersie ridicată în speciile de animale examinate, care, combinată cu o abatere medie ridicată, oferă o semnificație statistică medie. Deoarece dispersia aminoacidului valină este mică, rezultă cea mai semnificativă modificare a acestui model. 49

Rezultate pe un substrat oxidabil care inhibă sau încetinește oxidarea acestuia (Halliwell, 1990). Trebuie remarcat faptul că, pe lângă aminoacizii oxidabili, zahărul, ADN-ul și lipidele pot servi și ca substraturi. Este deosebit de interesant faptul că metionina se acumulează în proteinele membranei mitocondriale interne, care este cauzată biologic de prezența a doi codoni de metionină în proteinele codate mitocondrial ale lanțului respirator. S-a emis ipoteza că acumularea de metionină în aceste proteine și dublarea asociată a codonului de metionină în ADN-ul mitocondrial se datorează cauzal producției și apariției crescute a ROS în acest organet sau compartiment (Bender și colab. ., 2008). Prin urmare, a fost de interes să se investigheze utilizarea metioninei în diferite compartimente sau zone ale celulei umane pentru a determina dacă se poate găsi o frecvență specifică topologic în utilizarea acestui aminoacid. Ca rezultat, secvențele de proteine umane din diferite zone subcelulare au fost analizate pentru conținutul lor de metionină. 52

Rezultate 5.2.1 Compararea utilizării metioninei în diferite zone subcelulare Figura 10: Utilizarea metioninei în proteinele umane în diferite zone subcelulare. Fiecare linie verticală simbolizează o singură proteină, a cărei poziție corespunde rangului în utilizarea metioninei în curba de distribuție prezentată mai jos. Liniile verzi reprezintă media respectivă, liniile roșii pentru mediana respectivă de utilizare a metioninei în compartimentele examinate. Linia verticală continuă marchează mediana globală a tuturor secvențelor de proteine examinate în 19806. Figura 10 prezintă distribuția statistică a metioninei în proteinele umane în diferite zone subcelulare. Următoarele abrevieri au fost utilizate în Figura 10 și în Tabelul 14 53

Rezultate O comparație a celor patru complexe de lanț respirator I, III, IV și V, în care subunitățile provin atât din nucleu, cât și din mitocondrie, arată, de asemenea, o frecvență diferită de utilizare a metioninei. În medie, complexul I constă din 5,84% metionină la toate speciile de animale examinate, 2,64% la animalele cu un codon Met și 6,82% metionină la animalele cu doi codoni Met; Complexul III în total de la 3,79% metionină, la animalele cu un codon Met de la 2,30% și la animalele cu doi codoni Met de la 4,24% metionină. Complexul IV în total de la 4,72%, la animalele cu un codon Met de la 3,42% și la animalele cu doi codoni Met de la 5,11% metionină; Complexul V la toate speciile de animale de la 5,31%, la animalele cu un codon Met de la 3,17% și la animalele cu doi codoni Met de la 5,97% metionină. Cea mai mare diferență în cadrul diferitelor complexe poate fi observată în complexul I. Există o diferență în frecvența consumului de metionină de 4,18% între animalele cu un codon Met și animalele cu doi codoni Met. 60

Rezultate Figura 12: Rata de supraviețuire a celulelor HT22 după incubare cu 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm și 200 µm CAM, DES, CYS și GSH timp de 72h (n> = 3). Substanțele CAM, DES, CYS și GSH solubile în apă utilizate în FIG 12 nu prezintă niciun efect toxic asupra celulelor HT22 la oricare dintre concentrațiile utilizate după incubare timp de 72 de ore. Figura 13: Rata de supraviețuire a celulelor HT22 după incubare cu 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm și 200 µm 2SH, 4SH, 8SH și 12SH timp de 72h (n> = 3). După 72 de ore de incubare a celulelor HT22 cu substanțele lipofile 2SH, 4SH, 8SH și 12SH, s-a constatat o toxicitate diferențiată. Odată cu creșterea concentrației, toxicitatea tuturor substanțelor crește. Efectul toxic este cel mai pronunțat cu 12SH, apoi cu 8SH, 4SH și 2SH. Toxicitatea se corelează astfel cu lungimea lanțului alchil și concentrația celor 62

Rezultate, concentrația nu a afectat efectul toxic. Doar CAM a prezentat o toxicitate scăzută dependentă de concentrație după 72 de ore. Figura 15: Supraviețuirea celulară a celulelor IMR90 (PD 28.1) după 72 de ore de incubație cu 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm și 200 µm 2SH, 4SH și 8SH (n> = 3 ). După 72 de ore de tratament al celulelor IMR90 cu substanțe din ce în ce mai lipofile 2SH, 4SH și 8SH, a existat, de asemenea, un nivel scăzut de toxicitate (Figura 15). Niciuna dintre cele trei substanțe aplicate nu a prezentat efecte clare dependente de doză. Figura 16: Rata de supraviețuire a celulelor IMR90 (PD 28.1) după incubarea 72h cu 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm și 200 µm 10SH, 12SH, 14SH (n> = 3 ). Rata de supraviețuire a celulelor IMR90 tratate cu 10SH, 12SH și 14SH timp de 72 de ore a crescut cu 64