Pasivarea suprafeței pentru protocolul de studii asupra proteinelor cu o singură moleculă (tradus în germană)

rezumat

Descriem o metodă pentru pasivarea unei suprafețe de sticlă folosind polietilen glicol (PEG). Acest protocol include curățarea suprafeței, funcționalizarea suprafeței și acoperirea PEG. Introducem o nouă strategie pentru tratarea suprafeței cu molecule PEG în două runde, care are ca rezultat o calitate superioară a pasivării în comparație cu metodele existente.

Abstract

Introducere

Atunci când se efectuează un studiu proteic cu o singură moleculă, este important să se obțină o calitate ridicată a pasivării, astfel încât experimentul să fie lipsit de orice defecțiune sau denaturare 1,2 a proteinelor. În timp ce o suprafață de sticlă cu surfactanți, cum ar fi albumina serică bovină, este utilizată în mod obișnuit pentru studiile cu acid nucleic cu o singură moleculă 3, nivelul de pasivare nu este suficient de ridicat pentru studiile cu proteine. O suprafață de sticlă acoperită cu polimer (polietilen glicol, PEG) este superioară în performanța de pasivare 4-6. Procedând astfel, a fost utilizat pe scară largă pentru studiile cu proteine ​​cu o singură moleculă, de când a fost introdus pentru un studiu de fluorescență cu o singură moleculă 7/10. Acoperirea cu polimer procesează mai multe tratamente de suprafață 7,11,12. Prin urmare, este dificil să urmați întreaga procedură fără instrucțiuni detaliate. Adesea nivelul pasivării suprafeței variază în funcție de protocolul urmat. Aici vă prezentăm un protocol robust cu instrucțiuni pas cu pas care vor elimina unul dintre blocajele majore ale studiilor de proteine ​​cu o singură moleculă. Vă rugăm să consultați ilustrația 1 pentru prezentare generală.

Protocol

1. Pregătirea și curățarea diapozitivelor

Camera de microfluid constă dintr-o lamă de cuarț și o lunetă de acoperire. Microscopie cu reflexie internă totală (TIRF) asemănătoare unei prisme, suprafața diapozitivului este imagistică. Prin urmare, este important să curățați bine o lamelă de cuarț cu soluție de H20, acetonă, KOH și piranha. Curățarea în mai mulți pași elimină moleculele organice fluorescente de pe o suprafață care interferează cu măsurătorile fluorescenței cu o singură moleculă. În plus, gravura piranha face suprafața de cuarț hidrofilă generând grupări hidroxil. Grupările hidroxil libere sunt pentru reacția de amino-silanizare în etapa 3.

O cameră microfluidică este compusă dintr-o lamă de cuarț și o buză a capacului. Când se folosește un microscop TIRF de tip prismă, suprafața unei sticle de acoperire nu este reprezentată. Prin urmare, este suficient să curățați un slip de acoperire numai cu H 2 O și KOH. În cazul în care trebuie acoperită o lamelă de acoperire (de exemplu, prin microscopia TIRF de tip țintă), se recomandă tratarea lamelelor cu soluție de piranha (pasul 1.7). Rețineți că, dacă PEGilarea suprafeței superioare nu este de înaltă calitate, ar putea acționa ca o chiuvetă pentru proteine ​​și ar putea duce la fluctuații ale concentrației de proteine.

  1. Clătiți cu H 2 O. Puneți lamelele de capac (24 x 30, 24 x 40 sau 24 x 50 mm 2) într-o cuvă de sticlă. De obicei, 5 până la 15 lamele de acoperire sunt plasate într-un singur vas. Clătiți capacul de alunecare de 3 ori cu MilliQ H 2 O
  2. Curățarea cu KOH. Înlocuiți apa cu 1 M KOH și detonați capacul pentru 20 de minute sau mai mult.
  3. Clătiți cu H 2 O. Clătiți lamelele de acoperire de 3 ori cu MilliQ H 2 O pentru a elimina urmele de KOH. Continuați cu pasul 3.

3. Amino-silanizarea foliilor și a paharelor de acoperire

Funcționalizarea suprafeței diapozitivului de cuarț și acoperirea alunecărilor cu grupare amină prin chimia amino-silanizării. Metanolul este utilizat ca solvent și acidul acetic ca catalizator pentru reacția de amino-silanizare.

  1. Clătiți cu metanol. Înlocuiți MilliQ H20 în vasele de colorare (de la PASUL 1 și 2) cu metanol. Păstrați lamelele și lamelele de acoperire în metanol până la pasul 3.3. Deoarece impuritățile din metanol, foliile și capacul alunecă în metanol pentru o perioadă de timp inutilă (de exemplu, câteva ore) se adsorb la suprafață.
  2. Se prepară soluția de amino-silanizare.
    1. Clătiți un balon Pyrex de mai multe ori cu metanol. Sonicați baloanele cu metanol timp de 5 minute sau mai mult. Se recomandă să aveți un piston dedicat care să fie păstrat curat.
    2. Se adaugă 100 ml metanol în balon.
    3. 5 ml de acid acetic.
    4. 3 ml APTES (3-aminopropiltrimetoxisilan) și se agită ușor.
  3. Silanizarea amino. Înlocuiți metanolul din vasele care conțin lamele de colorare și lamele de acoperire cu amestecul de reacție de aminosilanizare.
    1. Incubație timp de 20-30 min. Sonicați o dată timp de 1 min în timpul incubației.
  4. Clătiți cu metanol. Înlocuiți reacția de eininosilanizare cu metanol. Aruncați metanolul și adăugați o nouă soluție de metanol. Repetați acest proces de trei ori.

4. Pasivizarea suprafeței folosind polimer (prima rundă)

Pasivați suprafața acoperită cu amină a lamelor de cuarț și a lamelelor de acoperire prin conjugarea esterului NHS polietilen glicol (PEG). Această reacție se efectuează peste noapte cu concentrația de saturație a soluției PEG la pH 8,5.

Păstrați lamelele PEGylated și lamele de acoperire în N 2 la -20 ° C.

  1. Uscarea lamelor și a lamelelor de acoperire. Dezasamblați cu grijă lamela și lamela acoperind deplasând lamela într-o parte, clătiți-le cu MilliQ H 2 O și uscați-le cu N 2.
  2. Salvați diapozitive și diapozitive. Pentru utilizare imediată, urmați procesul pentru a doua rundă de PEGilare (pasul 6). Pentru a economisi pentru o perioadă mai lungă de timp, urmați pașii următori.
    1. Așezați o pereche de diapozitiv și capacul de alunecare într-un tub de 50 ml, astfel încât suprafețele PEGylated să fie orientate unul față de celălalt.
    2. Închideți parțial tubul, aspirați tubul și umpleți-l cu N 2. Acești pași ajută la conservarea zonei PEGilate pentru o perioadă lungă de timp. Înșurubați furtunul strâns și păstrați-l la -20 ° C. Calitatea foliilor rămâne bună până la 3 luni (Figura 3, dreapta).

6. Pasivizarea suprafeței cu polimer (runda a doua)

O altă rundă de PEGilare pentru a face stratul PEG mai dens și, de asemenea, pentru a stinge orice grupuri amino rămase pe suprafață. Utilizarea unor molecule scurte de NHS ester PEG (333 Da) va fi eficientă în penetrarea unui strat PEG existent. Este recomandat să faceți această a doua rundă de PEGylation chiar înainte de a face o prezentare de diapozitive.

  1. Pregătiți tampon de reacție. Se prepară tampon de bicarbonat de sodiu 0,1 M proaspăt (pH 8,5). Soluția înghețată de la pasul 4.2 poate fi de asemenea utilizată.
  2. Pregătiți soluția de PEGilare. Se dizolvă 7 μl de MS4-PEG 250 mM în 63 μl de tampon bicarbonat de sodiu.
  3. PEGilare. Urmați aceeași procedură ca la pasul 4.4. Incubație timp de 30 de minute până peste noapte.
  4. Uscarea lamelelor și a lamelelor de acoperire. Demontați perechea de alunecare și alunecare, clătiți-le cu MilliQ H 2 O, uscați-le cu N 2 și depozitați-le într-o cutie de pipetă curată. Pentru a asambla o cameră microfluidică, treceți la pasul 7.

7. Asamblați o cameră microfluidică

Asamblați o cameră microfluidică cu o pereche de lamelă de cuarț PEG și alunecare de acoperire. Banda pe două fețe este utilizată ca distanțier. Camera este sigilată cu epoxid și astfel soluțiile sunt introduse prin găurile din lamela de cuarț.

Diapozitive de cuarț reciclate. Foliile utilizate sunt reciclate prin îndepărtarea lamelelor de acoperire și a benzii adezive pe două fețe.

  1. După utilizare, camerele se depozitează în apă de la robinet. Incubarea pe termen lung în apă facilitează demontarea camerelor.
  2. Se fierb camerele în apă de la robinet folosind un cuptor cu microunde. Folosiți un pahar Pyrex. Gatiti 10 minute sau mai mult.
  3. Luați lamele de acoperire și benzile duble cu o lamă de ras. Împingeți o alunecare de cuarț nu perpendiculară pe planul acesteia. Altfel se va sparge. Păstrați lama de ras afară din canal. Nu vă faceți griji, altfel va zgâria canalul.
  4. Clătiți lamelele cu detergent de uz casnic, frecându-le cu degetele.
  5. Introduceți într-o cuvă de sticlă. De obicei, 5 până la 15 diapozitive pot fi date într-un singur vas. În 10% curățător de uz casnic și sonicați diapozitivele timp de 20 minute sau mai mult. Clătiți cu o cantitate mare de tobogane cu apă.
  6. Mergeți la pasul 1.2.

Rezultate reprezentative

După dispunerea camerei microfluidice (pașii 7.1 până la 7.6) și înainte de a efectua pasul 7.7, este recomandabil să efectuați controlul calității suprafeței PEG.

Dacă pasivarea suprafeței a fost realizată cu succes, există mai puțin de 10 proteine ​​nespecific adsorbite pe zonă de imagistică (25 mm x 25 mm) observate atunci când 1-10 nM proteină marcată fluorescent (Figura 3, stânga) pus în cameră.

Dacă una dintre etapele de purificare sau de reacție nu este efectuată în mod corespunzător, numărul proteinelor nespecific adsorbite crește, iar ecranul CCD poate deveni saturat de semnale fluorescente. De exemplu, dacă piranha etch este omisă, există de 100 de ori cantitatea de adsorbție nespecifică observată (Fig. 3a, cu mijloc stânga pentru a compara). Dacă a doua etapă de PEGilare este omisă, s-a observat de aproximativ 3 ori o cantitate mai mare de adsorbție nespecifică (Figura 3b). Un nivel scăzut de PEGilare a fost observat atunci când substanțele chimice expirate (de exemplu, APTES au fost depozitate la temperatura camerei timp de câteva luni) (datele nu sunt prezentate). Calitatea suprafeței scade, de asemenea, dacă a trecut o cantitate semnificativă de timp de când a existat un tip PEGylated (Figura 3a, vedea. Stânga Cu dreapta).

Din câte știm, este pentru prima dată când două runde de PEGilare au fost introduse pentru studii cu o singură moleculă. Cele două runde de PEGilare garantează cea mai înaltă calitate a formării stratului PEG (Imaginea 3b). Tipul superior de dublă PEGilare este prezentat în mod vizibil în filme (cf. 1a film Cu Film-1b). În aceste filme, semnalele de fundal de la moleculele fluorescente observate în soluție sunt utilizate pentru a fi mult mai slabe decât dubla PEGilare, ceea ce înseamnă că proteinele sunt astfel respinse de stratul dublu PEGilat. Deși procedura în doi pași este foarte recomandată, al doilea pas de PEGilare ar putea fi omis dacă experimentul dvs. este tolerabil pentru pasivare non-optimă.

asupra
Ilustrația 1:. Schema de tratamente de suprafață (a) a curățat o lamă cu acetonă, KOH și soluție de piranha. Este PEG funcționalizat cu APTES și ester PEG-NHS. (B) Un slip de acoperire este curățat cu KOH și, dacă este necesar, cu soluție de piranha. Este PEG funcționalizat cu APTES și ester PEG-NHS.

fig2highres.jpg "width =" 500 "/>Figura 2:. Cameră microfluidică (a) O cameră cu un singur canal. Diapozitivul pentru microscop are două găuri găurite în el. Se montează cu un glisier de acoperire cu două geamuri de bandă dublă. (B) O cameră cu trei canale. Diapozitivul pentru microscop are șase găuri găurite în el. Se montează cu un glisier de acoperire cu patru geamuri de bandă dublă.

pentru
Figura 3: imagini CCD cu proteine ​​marcate cu colorant înregistrate în soluție. (A) Imaginile CCD au fost luate în soluție prin microscopie cu fluorescență cu reflecție internă totală de tip prismă cu un obiectiv 60X cu 10 nM Cy3-label Rep. (Stânga) O suprafață a fost creată în conformitate cu protocolul din acest articol. (Mijloc) O suprafață a fost preparată în roșu conform protocolului din acest articol, dar a omis piranha etch. (Dreapta) Suprafața A a fost pregătită conform protocolului prezentat în acest articol și depozitată timp de 3 luni la -20 ° C sub azot. (B) Imagini CCD înregistrate cu 10 nM Cy3-label Rep în soluție. (Stânga) O suprafață a fost creată în conformitate cu protocolul din acest articol. (Dreapta) Suprafața A a fost pregătită conform protocolului din acest articol, dar a doua rundă de PEGilare a fost omisă. Bara de scalare = 5 µm.

Film 1: Filme CCD cu proteine ​​marcate cu colorant înregistrate în soluție. Filmele CCD au fost capturate în soluție prin microscopie cu fluorescență cu reflecție internă totală de tip prismă cu un obiectiv 60X cu 10 nM Cy3-label Rep. Rezoluția de timp este de 100 ms. (A) O suprafață a fost realizată conform protocolului prezentat în acest articol. (B) Suprafața A a fost pregătită conform protocolului din acest articol, dar a doua rundă de PEGilare a fost omisă. Faceți clic aici pentru a vizualiza Film-1a și faceți clic aici pentru a vedea Film-1b.

Discuţie

Pași critici în cadrul acestui protocol

Este important ca suprafața să fie hidrofilă înainte de reacția de amino-silanizare. Acest lucru a fost realizat prin gravarea piranha, care creează grupări hidroxil libere pe o suprafață de sticlă/cuarț. Se recomandă păstrarea suprafeței gravate de piranha pe H 2 O sau aer pentru o lungă perioadă de timp, deoarece hidrofilitatea suprafeței este expusă și scade.

Moleculele PEG de ester NHS sunt reactive. Se recomandă să se facă cantități parțiale și să se păstreze la -20 ° C sub azot.Durata de valabilitate a produselor chimice APTES la temperatura camerei este scăzută. Se recomandă înlocuirea acestuia cu una nouă în fiecare lună.

Modificări la acest protocol

Dacă nu utilizați gravarea piranha din orice motiv practic, puteți utiliza gravarea cu KOH pentru o perioadă mai lungă de timp (de exemplu, peste noapte), ceea ce îl va face, de asemenea, expus grupărilor hidroxil. Capătul acestei abordări alternative este că glisorul devine inutilizabil după câteva repetări din cauza zgârieturilor severe.

Se practică adesea arderea unei lanterne cu propan de suprafață din sticlă/cuarț, care este eficientă în îndepărtarea materialelor organice fluorescente 7. Această procedură a fost inclusă în acest protocol, deoarece este gravarea piranha redundantă. Rețineți că această procedură poate duce la oxidarea grupărilor hidroxil. Prin urmare, această procedură nu trebuie efectuată dacă o suprafață a fost gravată utilizând soluție KOH sau piranha.

Când se utilizează un tampon cu pH sub 7 pentru imagistica cu o singură moleculă, conformația se schimbă din „ciupercă” PEG în „perie”, indicând gradul de pasivare. Prin urmare, dacă se utilizează pH sub 7,0, se recomandă ca suprafața cu disuccinimidil ester tartarat 7.

Perspective

Această lucrare a oferit un protocol robust pentru realizarea unei pasivări de suprafață de înaltă calitate. Acest protocol va fi util pentru studii de fluorescență cu o singură moleculă care implică proteine ​​14 și 15 imunoprecipitate cu proteine, precum și complexe de proteine ​​din extracte de celule. Este utilizat pe scară largă pentru alte tehnici cu o singură moleculă, cum ar fi spectroscopia de forță și cuplu 16. De asemenea, va fi utilizat pentru a preveni adsorbția celulelor pe o suprafață 17.

Protocolul furnizat în această teză necesită procedura sa în mai mulți pași. Pasivarea suprafeței cu lipida-PEG-8 și poli-lizina-PEG-9 sunt disponibile ca alternative. Deoarece nu necesită reacții chimice, este ușor de implementat. Cu toate acestea, gradul de pasivare nu este la fel de mare ca cel obținut prin modificarea chimică a unei suprafețe.

Dezvăluiri

Nu avem nimic de dezvăluit.

Mulțumiri

SDC, ACH și CJ au fost susținute de Starting Grants (ERC StG ​​- 2012-309509) de la Consiliul European de Cercetare. J.-MN a fost susținut de Fundația Națională de Cercetare (NRF) (2011-0018198) Coreea; și Programul Centrului de Cercetare Pioneer (2012-009586) finanțat de NRF din Coreea prin Ministerul Științei, TIC și Planificarea Viitoare (MSIP). Această lucrare a fost, de asemenea, susținută de Centrul pentru Sănătate BioNano-Guard din MSIP Coreea ca proiect de frontieră globală (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL și J.-HH au fost susținuți de Programul de bursă științifică din Seoul din orașul Seoul, Coreea. Proteina Rep etichetată a fost un dar generos de la Dr. Sua Myong.