PDF 3 Material și metode - Descărcare gratuită PDF
Scurta descriere
1 3 Material și metode 3.1 Amenajarea experimentală, materialul animal, păstrarea și hrănirea În două etape experimentale .
Descriere
Configurarea experimentală, materialul animal, păstrarea și hrănirea
Influența vâscozității digestive asupra morfologiei și histologiei intestinului subțire al porcilor a fost investigată în două teste. În acest scop, s-au format un grup de control și un grup de testare format din câte șase porci. În prima probă, s-a hrănit o rație semisintetică bazată pe amidon de porumb și izolat de proteine din soia (dieta C). Pentru a crește vâscozitatea digestivă, 2% din celuloză cristalină a fost înlocuită cu carboximetilceluloza substratului model foarte vâscos (dietă CMC). În cea de-a doua probă, s-a alimentat o dietă care consta în principal din secară și grâu și conținea astfel factori naturali de creștere a viscozității (dieta K). Vâscozitatea digestei grupului testat (dieta E) a fost redusă prin adăugarea unui preparat enzimatic care conține xilanază (Zy 68; 480 UI/kg furaj). Tabelul 1 prezintă compozițiile diferitelor diete; Tabelul 2 prezintă conținutul de nutrienți și viscozitățile extractului respectiv.
Tabelul 1: Compoziția dietelor semi-sintetice C și CMC, precum și a dietelor pe bază de cereale K și E.
Componente [g/kg uS] amidon de porumb secară grâu proteine din soia izolate celuloză, cristalină 1 carboximetil celuloză 2 glucoză ulei de soia fosfat monocalcic furaj var, premix carbogazat3 potasiu hidrogen carbonat oxid de magneziu lizină metionină treonină triptofan Zy 684
680 134 50 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
680 134 30 20 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 0,4
1Viva Pur ® tip 200; Rettmaier & Sons fabrică celuloză, Ellwangen-Holzmühlen 2Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germania 3Lohmann Animal Health & Co.KG, Cuxhaven; Conținut pe kg: 1,2 milioane UI Vit A; 120.000 UI Vit D3; 4 g Vit E; 200 mg Vit B1; 600 mg Vit B2; 2500 mg niacină; 400 mg Vit B6; 4,5 mg Vit B12; 20 mg biotină; 1800 mg acid pantotenic; 160 grame sodiu; 50 de grame de magneziu; 10 grame de zinc; 7,5 g fier; 7,5 g mangan; 150 mg de iod; 70 mg cobalt; 40 mg seleniu 4Lohmann Animal Health & Co. KG, Cuxhaven; Zy 68 conține activitate de xilanază 1192 UI per g
Material și metode Tabelul 2: Conținutul nutritiv analizat și calculat al dietelor semisintetice C și CMC, precum și al dietelor pe bază de cereale K și E.
Substanță uscată Proteină brută Grăsime brută Cenușă Fibre brute NfE NDF ADF Total NSP1 (solubil)
900,7 115,0 19,9 44,6 (50) 4 671,2 * * *
896,6 116,2 25,3 32,8 (30) 4 692,3 * * *
Arabinoza (solubilă) Xiloză (solubilă) Manoză (solubilă) Glucoză (solubilă) Galactoză (solubilă) Energie convertibilă [MJ/kg uS] 2 Proteină brută aparent digerabilă cu precizie3 Vâscozitatea extrasului [mPas]
901,9 131,9 32,9 51,3 17,0 668,6 145,9 27,4 103,4 (24,8) 19,4 (4,7) 50,2 (11,8) 4,0 (1,5) 26,0 (5,7) 3,8 (1,1) 13,4
898,9 131,9 31,4 49,7 17,3 668,6 134,6 28,0 102,6 (30,5) 19,1 (4,9) 49,4 (13,0) 2,7 (0,8) 27,8 (9,8) 3,6 (2,0) 13,4
1 determinat așa cum este descris în Bartelt și colab. (2002) 2calculat în funcție de conținutul energetic al componentelor individuale (DLG, 1991) 3calculat în funcție de conținutul și informațiile de digestibilitate pentru proteina brută în secară, grâu și proteine din soia izolate în CVB (1996) și Grala et al. (1998) 4 nu corespunde conținutului de celuloză cristalină * din dietă
Cele 24 de animale testate au fost porci din programul Schaumann. În acest program de reproducere, rasele încrucișate ale raselor germane Landrace și Duroc sunt utilizate ca linie de baraj, iar rasele încrucișate ale raselor Landrace B și Hampshire sunt utilizate ca linie tată. Toți purceii au primit o injecție de fier-dextran la vârsta de trei zile; masculii au fost castrați în a 15-a zi de viață. Șase purcei au fost selectați la întâmplare din două așternuturi simultane, indiferent de sex, și înțărcate în a 28-a zi de viață. Cei șase colegi au fost împărțiți în mod egal între grupul de control și test (C sau CMC sau K sau E). Perioada de hrănire a durat trei săptămâni în ambele probe. Porcii au fost adăpostiți în cutii individuale cu o suprafață de 1,20 x 1,60 m, cu o podea completă. A existat contact vizual între cutiile vecine. Porcii din diferite grupuri nu au avut contact direct. 29
Au fost hrăniți zilnic la 8:00 și 16:00, furajele asemănătoare făinii fiind amestecate cu de trei ori cantitatea de apă. Cantitatea de rație a fost adaptată la aportul de hrană ad libitum astfel încât să fie de 100 g în prima zi și în medie de 1100 g în ultima zi a experimentului. Înainte de hrănirea după-amiezii, cutiile erau curățate cu apă în fiecare zi. În acest timp, trei cutii din fiecare grup de alimentare au fost conectate între ele. Starea generală a porcilor a fost verificată zilnic. În cele trei săptămâni ale experimentului, porcii au avut la dispoziție diverse jucării, cum ar fi bilele, bare metalice rotunjite sau discuri de plastic. Animalele au fost cântărite atât la începutul experimentului, în a 28-a zi de viață, cât și cu o zi înainte de sfârșitul experimentului.
apoi deschis longitudinal și în cele din urmă clătit de trei ori în soluție călduță fiziologică clorură de sodiu. Părțile intestinale au fost întinse pe prosoape de hârtie pentru măsurarea lungimii și lăsate acolo să se usuce timp de aproximativ cinci minute. Secțiunile individuale au fost apoi cântărite. Toți pașii individuali au fost efectuați de aceeași persoană. Pe parcursul întregii proceduri, sa acordat atenție particularităților și proceselor patologice recunoscute macroscopic. Greutatea și lungimea secțiunilor intestinale individuale în raport cu greutatea corporală au fost calculate într-un moment ulterior din parametrii greutății și lungimii secțiunilor intestinale individuale. Mai mult, coeficientul de lungime și greutate a fost înregistrat ca o măsură a grosimii peretelui intestinului subțire și gros.
Măsurarea vâscozității digestive
Digesta îndepărtată a fost răcită în gheață imediat după ce a fost obținută până când probele au fost centrifugate la 13.000 rpm (accelerație centrifugă relativă 13600 g) timp de 10 minute (centrifugă tip 5415 C din Eppendorf, Germania). Vâscozitatea a 0,5 ml de supernatant a fost determinată cu ajutorul unui viscozimetru (tip LVDV II; cap de măsurare tip fus conic CP-40; temperat la 40,0 ° C, Brookfield, SUA). Dacă a fost disponibil suficient material de probă, s-au efectuat măsurători duble. La cinci animale, nu exista digeste în ileon în momentul prelevării.
Pentru fixare (20 de ore la temperatura camerei) în soluția Bouin modificată (4% acid picric + 2,5% acetat de cupru + 3,5% formol), probele de țesut au fost întinse pe plăci de plută cu vârfuri de arici. Aceasta a fost urmată de câteva clătiri cu etanol 70% pe o perioadă de 24 de ore. Preparatele au fost în continuare deshidratate în total 48 de ore cu ajutorul unei serii de alcool în creștere (de 4 ori 2 ore 80%, 30 minute 90%, de 2 ori 30 minute 96%, de 4 ori 1 oră 100% etanol; clarificare cu xilen I, II și III 20 de minute de fiecare dată; de fiecare dată la temperatura camerei). După scăldat în parafină moale cu un punct de topire de 46 ° C, probele au fost încorporate în parafină tare la 60 ° C (punct de topire 57 ° C).
Probele de țesut de aproximativ 1,5 cm², întinse pe plăci de plută, au fost fixate timp de 24 de ore în următoarea soluție: 2% paraformaldehidă + 2,5% glutaraldehidă în tampon de cacodilat 0,1 M, pH 7,2. Apoi au fost clătite de mai multe ori cu tamponul de clătire menționat în capitolul 3.4.2 și fixate cu soluția corespunzătoare de tetroxid de osmiu timp de 2 ore la temperatura camerei. După clătiri repetate, probele au fost spălate pe o serie ascendentă de alcooli (de 2 ori 30 minute 50 și 70%; 30 minute 80% etanol I, 16 ore 80% etanol II, 2 ori 30 minute 90 și 96% și de 4 ori 30 minute 100 % etanol; fiecare la 4 ° C) deshidratat. Acesta a fost urmat de un tratament de 2 ore cu HMDS (1-1-1-3-3-3 hexametildisilazan; Roth 3840.2) la temperatura camerei înainte ca preparatele să se evapore peste noapte (temperatura camerei). După ce preparatele au fost lipite pe plăci de probă folosind tablă conductivă (Plano), acestea au fost depozitate într-un dulap de vid până la pulverizare (un minut; Sputter Coater S150B, Edwards Company, Anglia).
Prezentare generală a colorării, precum și dovezi ale proliferării și apoptozei pentru microscopia cu lumină
Pentru examinările morfologice și morfometrice, secțiuni groase de 5 µm au fost colorate cu hematoxilină-eozină (HE). În plus, secțiuni de aceeași grosime au fost colorate cu reactiv Schiff acid periodic albastru Alzian (PAS-AB), pH 2,5. Coloranții folosiți aici colorează diferit substanțele mucoase (mucine) din celulele calice în funcție de valoarea pH-ului lor. Pe de o parte, acest lucru simplifică foarte mult identificarea celulei calice; pe de altă parte, mucinele acide sunt prezentate în albastru, în timp ce mucinele neutre sunt prezentate în roșu (Romeis, 1989). Nu s-a mai făcut o diferențiere a mucinelor. Pentru a determina rata de proliferare și apoptoză, au fost efectuate dovezi speciale, care sunt descrise individual mai jos.
Detectarea celulelor active de proliferare
Principiul metodei de detectare Bromodeoxiuridina analogică a timidinei (BrdU) a fost administrată intraperitoneal la porcii ante mortem timp de o oră la o concentrație de 15 mg/kg greutate vie. În această oră, uridina modificată a fost încorporată în materialul genetic al acestora de către celule în faza S a ciclului celular. BrdUridina încorporată este marcată de anticorpi monoclonali de la un șoarece. Anticorpii primari legați sunt vizibili cu metoda peroxidază-anti-peroxidază (PAP), o imunoglobulină de la un iepure care servește ca anticorp de legătură (Romeis, 1989). Nucleurile care conțin BrdU apar maro. Reactivii utilizați pentru aceasta au fost după cum urmează: SILANES: Lamele au fost acoperite conform instrucțiunilor Sigma A3648. TBS I: tampon de spălare I (soluție salină tamponată TRIS); 0,1 M TRIS + 0,1 M NaCI + 0,05 M MgCl; pH 7,5 Tampon de incubare: 0,05 M TRIS + 0,9% NaCI + 0,66 mM MgCl2 + 1% BSA + 0,1% gelatină (Merck 4078) TBS II: tampon de spălare II; 0,05 M TRIS + 0,9% NaCI; pH 7,6 tripsină: 0,1% + 0,1% CaCI2 în TBS I (pH 7,6 până la 7,8) SwNS: ser normal de porc (DAKO X 0901); pentru preincubare 20% în reactivi de detectare TBS I (incubație): Incubație I: MaBrdU (DAKO M 07444; anticorp monoclonal de șoarece împotriva BrdU); 1:25 în tampon de incubație + 2% SwNS 33
Incubație II: RaMIg (DAKO Z 0259; anticorpi ai unui iepure împotriva imunoglobulinelor șoarecelui); 1:40 în tampon de incubație + 2% incubare SwNS III: mouse PAP (DAKO B 0650); 1: 250 în tampon de incubație + 2% SwNS BSA:
albumină serică bovină (Roth 8076.2)
Principiile metodelor de detectare În timpul apoptozei, fragmente caracteristice de ADN apar din activitatea endonucleazei proprii a celulei. O posibilitate de detectare histologică a acestor fragmente este cea a lui Gavrieli și colab. (1992) au descris metoda TUNEL (marcarea deoxinucleotidil transferazei terminale (TdT) mediată dUTP-biotină nick-marking final). Se bazează pe legarea specifică a enzimei deoxinucleotidil transferază (TdT) la capetele 3'-OH ale ADN-ului. Această enzimă cuplează trifosfații deoxiuridină marcate cu biotină (biotină-dUTP) la capetele fragmentelor de ADN. Biotina este în cele din urmă vizibilă conform metodei PAP. Complexul streptavidină-biotină utilizat aici, la care peroxidazele sunt cuplate chimic, înlocuiește anticorpii (Gavrieli și colab., 1992). Într-o altă metodă, este detectată prezența unei enzime tipice pentru apoptoză, caspaza-3. Enzimele din citoplasmă sunt marcate cu ajutorul unui anticorp specific de la un iepure. Anticorpii primari sunt vizibili utilizând metoda PAP deja menționată. Anticorpul pod utilizat în acest caz provine de la o capră.
Reactivii utilizați pentru TUNEL au fost după cum urmează: TBS: 0,05 M TRIS-HCI (pH 7,6) + 0,9% NaCl TdT tampon: 30 mM TRIS + 140 mM Na cacodilat + 1 mM CoCl2; tampon pH 7,2 TB: 0,3 M NaCI + 0,03 M citrat de Na; pH 8,0 Biotin-dUTP: Boehringer 1093 070, soluție originală (50 nM/50 pl) diluată 1:10 cu PBS; soluție utilizată 5 nM/50 µl (depozitate în porțiuni la -20 ° C) TdT:
Boehringer 220 582, timus de vițel; Soluția originală (500 U/20 pl) diluată 1:25 cu glicerol 50% în PBS; soluție utilizată 500 U/500 µl (depozitată în porții la -20 ° C)
Albumină serică bovină (Roth 8076.2; depozitare la 4 ° C)
SABC-KIT: Complex Streptavidin-biotină (DAKO K0377; depozitare la 4 ° C) DAB: 37,5 mg diaminobenzidină/150 ml TBS + 70 pl H2O2 30% proteină kinază; FLUKA 82456; 5, 10, 15, 20, 50 sau 100 pl/ml TBS DNAse: 0,5 U/pl (Boehringer Mannheim, 776785) Procedură Secțiunile de parafină groase de 3 um au fost trase pe lamele corespunzătoare și îmbibate ca pentru detectarea proliferării. Preparatele au fost apoi decolorate în metanol cu 0,3% peroxid de hidrogen (30 minute) și apoi clătite cu apă dublu distilată. Pentru a 35-a
Următorii reactivi au fost utilizați pentru detectarea caspazei-3: tampon citrat: 0,01 M; pH 6,0 PBS: soluție salină tamponată cu fosfat; fără ioni Ca și Mg; pH 7,4 BSA: ser albumină bovină (ROTH 8076.2; depozitare la 4 ° C) NSfS: ser normal de oaie (DAKO X0503; depozitare la 4 ° C) SNC: ser normal de capră (DAKO X0907; depozitare la 4 ° C) iepuri -Serum: DAKO X0902; Depozitare la 4 ° C DAB: 20 mg diaminobenzidină/100 ml PBS + 25 pl H2O2, 30%; pH 7,6 Anticorpi utilizați: RahCaspase-3: Serotec AHP476 (anticorp al unui iepure împotriva caspazei-3 umane); 1: 100 în PBS + 2,5% CNS + 0,1% BSA (depozitare la 4 ° C.) GaR-Ig: DAKO Z0421 (anticorpi de capră împotriva imunoglobulinelor unui iepure); 1:20 în PBS + 1% BSA (depozitare la 4 ° C) Rabbit-PAP: DAKO Z113; 1:40 în PBS + 1% BSA (depozitare la 4 ° C)
Examinare microscopică cu lumină și electronică
Examinările microscopice cu lumină au fost efectuate cu ajutorul unui axioscop din Zeiss, Germania. La examinarea secțiunilor colorate cu HE, s-a acordat o atenție deosebită formei vilozităților, cursului criptei și indicațiilor apariției apoptozei, pe lângă anomalii. Secțiunile colorate cu PAS-AB (pH 2,5) au fost evaluate în ceea ce privește distribuția celulelor calice și valorile pH-ului mucinei care apar. Înainte de a evalua specimenele pe care au fost efectuate dovezile specifice (proliferare și apoptoză), specificitatea metodei a fost verificată mai întâi folosind controalele pozitive sau negative. Ulterior, sa acordat o atenție deosebită apariției și localizării structurilor care urmează să fie detectate. Examinarea microscopică electronică de scanare a fost efectuată pe un dispozitiv de la Bausch & Lomb, Canada, de tip Nanolab 2000. Evaluarea probelor microscopice transelectronice a fost efectuată pe un dispozitiv EM 10 CR din Zeiss, Germania.
a fost în cele din urmă exprimată în numărul de proliferări pe mm de circumferință a criptelor. În plus, cantitatea totală de celule epiteliale care se divid activ într-o anumită secțiune a membranei mucoase a fost calculată prin înmulțirea ratei relative de proliferare cu factorul de mărire corespunzător al suprafeței membranei mucoase cauzat de formarea criptelor. Valoarea rezultată exprimă câte proliferări sunt prezente în epiteliul criptei pe o anumită lungime a laminei musculare mucoase. În cele din urmă, a fost calculat indicele de reînnoire epitelială. În acest scop, cantitatea totală de celule epiteliale care se divid în mod activ a fost stabilită în raport cu dimensiunea suprafeței vilozităților. Indicele de reînnoire indică câte noi celule epiteliale apar în raport cu suprafața vilozității [proliferare/mm suprafață a vilozităților].
Toți parametrii au fost determinați pe fiecare porc și în toate cele trei secțiuni ale intestinului. În cazuri individuale probele luate au fost inutilizabile. Valoarea medie a fost formată din valorile aceluiași parametru, care au fost înregistrate de mai multe ori pentru fiecare animal și fiecare secțiune. Pentru a rezuma cei șase porci dintr-un grup, s-a determinat și media aritmetică. Comparațiile parametrilor individuali dintre grupuri au fost efectuate utilizând o analiză a varianței cu doi factori. Nivelul de semnificație a fost de 0,05. Pentru a ține seama de efectele deșeurilor, factorul „Litter” a fost cuibărit în factorul „Group”. A fost apoi efectuat un test de bună-potrivire Kolmogorov-Smirnov cu reziduurile standardizate pentru a verifica existența unei distribuții normale. S-ar putea presupune o distribuție normală pentru toți parametrii. Pentru a examina diferențele de parametri între secțiunile individuale ale intestinului subțire, valorile tuturor porcilor au fost mai întâi mediate. Apoi s-a efectuat un test t pentru probele asociate, nivelul de semnificație fiind, de asemenea, 0,05. Analizele au fost efectuate cu ajutorul programului de calculator SPSS pentru Windows, 9.0.1, 1999.