Pregătirea și utilizarea celulelor musculare netede izolatoare umane proaspăt izolate pentru
rezumat
Descriem o metodă de preparare a celulelor netede izolante detrusor proaspăt izolate din specimenele din rezervorul urinar uman folosind o procedură enzimatică în doi pași. Celulele DSM viabile rezultate pot fi studiate prin diferite tehnici cu o singură celulă, inclusiv electrofiziologia cu clemă de patch-uri amfotericină-B descrisă pentru a dezvălui proprietăți fiziologice și farmacologice.
Abstract
Introducere
La sfârșitul anilor 1980 și începutul anilor 1990, grupul Isenberg (Germania) a publicat o serie de studii electrofiziologice asupra celulelor DSM proaspăt izolate obținute din vezicele urinare de cobai 9, 10, 11, 12, 13 (tabel1). Metoda a evidențiat două observații importante care au ajutat la securizarea celulelor vitale și au servit drept ghid inițial pentru alții de urmat. Au fost 1) pre-tratarea bucăților izolate de DSM cu soluție de Ca2-liber/mediu înainte de tratamentul cu enzime și 2) digestia țesutului cu o soluție care conține colagen. Acești doi pași critici au fost încorporați în toate variantele ulterioare ale procedurilor de disociere a celulelor DSM (tabelul 1). În prezent, grupul nostru folosește o abordare secvențială în două etape de disociere a papainei-colagenazei. Bucățile de DSM sunt tratate mai întâi cu o soluție enzimatică care conține papaină, apoi cu colagen de tip II solubilizat în aceeași soluție (DS, soluție de disecție/digestie). Această abordare produce celule DSM unice de la diverse specii, inclusiv cobai, porci, șobolani, șoareci și mai ales umane (tabelul 1).
Luată împreună, metoda descrisă aici pentru obținerea celulelor DSM unice proaspăt izolate din vezica urinară umană oferă celule viabile foarte potrivite pentru investigații electrofiziologice folosind diverse configurații ale tehnicii de fixare a patch-urilor, imagistica Ca 2, imunocitochimie, test. Pentru litigii proxime in situ și RT-PCR/qRT-PCR cu o singură celulă, precum și tehnici avansate de biologie moleculară, inclusiv microarray, ARN-seq și analiza CHIP-seq. Utilizarea metodei de fixare a plasturelui perforat de amfotericină-B păstrează mediul celular nativ spre deosebire de alte configurații. Atunci când rulează folosind condițiile specifice descrise aici, concepute pentru a anula intrările de curenți K și Ca 2 în celulele DSM, curenții induși de tensiune prezintă proprietățile curenților de cationi neselectivi adecvați pentru caracterizări biofizice și farmacologice.
Protocol
Toate metodele descrise aici au fost aprobate de comitetele Consiliului de revizuire instituțională al Universității din Tennessee Center for Health Sciences (Memphis, TN, IRBMD 17-05714-XP) și de Universitatea Medicală din Carolina de Sud (Charleston, SC, IRBMD 00045232). Procedurile aprobate permit prelevarea de probe de vezică urinară de toată grosimea (cu '1 cm pe' 1 cm) - conținând toate straturile, inclusiv mucoasa, mușchiul detusor net și seroza, care sunt atașate de vasele de sânge și țesutul adipos) - de la pacient -donatorii supuși îndepărtării parțiale chirurgicale a vezicii urinare. Pacienții donatori sunt adulți (grupa de vârstă studiată până acum: 25 până la 87 de ani), bărbați sau femei, cu sau fără simptome de vezică urinară hiperactivă (clasificată de American Urological Association I-PSS scor 41). Procedurile chirurgicale implică o varietate de afecțiuni medicale, inclusiv cistectomia radicală pentru carcinomul urotelial și adenocarcinomul. În astfel de cazuri, specimenul rezervor de urină colectat este îndepărtat de la locul tumorii.
1. Disecția țesutului DSM și prepararea pieselor DSM fără mucoasă
2. Disocierea enzimatică a bucăților de DSM dând celule unice de DSM proaspăt izolate
3. Înregistrarea curenților de cationi induși de pasul de tensiune al celulelor DSM utilizând întreaga tehnică de corecție a tensiunii celulare perforată de amfotericină-B
4. Analiza și vizualizarea datelor