Prezentat de Michael Preukschas născut la Bremen - PDF descărcare gratuită
Deoxihipusina sintază ca posibilă țintă pentru tratamentul glioblastomului multiform și rolul disertației in vivo a factorului de inițiere a traducerii eucariote eif-5a2 pentru a obține titlul de doctor în științe naturale în cadrul Departamentului de biologie, Facultatea de matematică, informatică și științe naturale, Universitatea din Hamburg prezentat de Michael Preukschas născut la 27 septembrie 1981 la Bremen Hamburg 2012
Versiune corectată Data disputării: 30.08.2013 1 recenzor: Prof. Dr. Joachim Hauber Recenzor 2: Prof. Dr. Julia Kehr ii
Marea tragedie a științei - uciderea unei ipoteze frumoase de un fapt urât. "Thomas Henry Huxley Discurs prezidențial la British Association for 1870," Biogenesis and Abiogenesis "(Collected Essays, vol. 8) iii
Lista abrevierilor 6! Pe parcursul2acestei2 lucrări2produse2publicații2 și! Prezentări poster2. 2100! 7! Literatura2. 2102! A 8-a! Anexa 2. 2115! 8.1! Secvențe de bază 2. 2115! 8.2! Lentiral2 vectori2. 2116! 8.3! eifj5ajexpression2in2glioblastomen2 (rembrandtjdatabase) 2. 2117! 8.4! Afidavit2asigurare2. 2122! iv
Lista abrevierilor TMZ TPZ OMS Temozolomidă care propagă tumorile celule Organizația Mondială a Sănătății (Organizația Mondială a Sănătății) iii
Rezumatul stă. Cu ajutorul acestui șoarece knockout, se pot obține noi cunoștințe despre funcțiile sistemice și organice specifice la mamifere. iii
Inițierea exprimată parțial la nivelul mrna, dar aproape nedetectabilă la nivelul proteinei 5,6,8. Ambele proteine sunt codificate de propria lor genă și fiecare transcrisă în cinci transcrieri. Unele dintre transcrieri au 3 -UTR diferite sau sunt trunchiate, ceea ce are o influență asupra ratei de traducere și a formării polisomului eif-5a2-mrna, în special în cazul transcrierilor eif-5a2 și este posibil implicată în reglarea expresiei 8. Eif-5a2-mrna are, de asemenea, o stabilitate mai mică decât cea a eif-5a. Astfel, cel puțin o parte din expresia diferită a celor două izoforme pare a fi explicabilă prin aceste mecanisme post-transcripționale. Enzima DHS este responsabilă pentru primul pas în sinteza hipusinei. Majoritatea eucariotelor au o singură genă dhps, conservată în eucariote și arhee, care codifică DHS. Până în prezent, la om s-au găsit trei variante de transcriere, dintre care doar o singură codifică o proteină activă 9. Poliamina spermidină servește ca substrat pentru DHS. Transferul reziduului de aminobutil din spermidină în eif-5a-lizină 50 este un proces dependent de NAD și, în principiu, reversibil. DHS este un
Introducere pentru a reduce moartea legată de apoptoză a celulelor insulelor pancreatice. Rolul eif-5a în reacțiile inflamatorii, care sunt cruciale pentru dezvoltarea diabetului, s-a reflectat și în alte scenarii. O formă eliberabilă oral de CNI-1493 numită CPSI-2364 a fost testată pentru tratamentul bolii Crohn, o boală autoimună inflamatorie cronică a intestinului. Și aici s-a arătat un efect antiinflamator, care a fost asociat cu inhibarea DHS. Ipoteza că proteinele eif-5a și enzimele formatoare de hipusină sunt implicate în patogeneza multor neoplasme maligne este susținută de un număr tot mai mare de studii. Prin urmare, evaluarea implicării acestor proteine în alte tipuri de cancer a fost o alegere evidentă. Aici, neoplasmele maligne au avut un interes deosebit, pentru care doar câteva opțiuni terapeutice eficiente au fost disponibile până acum. Acestea includ, în special, tumori cerebrale de grad superior, tratamentul cărora are rareori succes, indiferent dacă este chirurgical, cu radio/chimioterapie clasică sau terapii moleculare vizate. Prin urmare, eif-5a1/2, DHS și DOHH au fost investigate ca posibile ținte terapeutice în astrocitoamele de grad superior. 9
Introducerea oncogenelor specifice la fiecare pacient va fi necesară, având în vedere eterogenitatea dintre tumori. Deoarece există, de asemenea, o mare eterogenitate și u. Poate exista o dezvoltare clonală în cadrul unei tumori GBM 120 și o biopsie de multe ori nu poate detecta toate mutațiile 121, tehnologii noi, eficiente din punct de vedere al costurilor (de exemplu, secvențierea exomului) și direcționarea diferitelor ținte non-redundante va ajuta probabil la atenuarea acestor dificultăți a trece peste. 18
Material și metode 19 2 Material și metode 2.1 Material 2.1.1 Produse chimice și medii pentru bacterii Tabelul 2: Produse chimice și reactivi utilizați în această lucrare. Chimic/reactiv/mediu Aceglow ECL-Soluție Acrilamidă-Bis, 30% Adriamicină (Doxorubicină) Agaroză Ampicilină BCNU Bradford Reactiv BSA Bromofenol Albastru Ser de vițel (FCS) Glutaraldehidă (50%) Glicină Glicerină Hemal în funcție de Mayer Isopropanol Acetat de potasiu Producător Peqlab Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bio-Rad Roth Roth Roth Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Invitrogen Roth Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Roth Roth Roth Roth Roth Roth 19
Material și metode 20 Clorură de potasiu LB agar LB mediu Lapte praf degresat β-mercaptoetanol Metanol (MeOH) M-MuLV Acetat de sodiu Clorură de sodiu Hidroxid de sodiu Ortovanadat de sodiu Aminoacizi neesențiali Oligo d (t) Primer Paraformaldehidă PBS Penicilină/Streptomicin Rotiszint eco plus acid clorhidric (HCl) SDS SOC-Medium Spermine Spermidine SYBR Green PCR Master Mix TEMED Temozolomide Tritium spermidine Tris Base Tris-HCl TriFast Roth Roth Roth Roth Sigma-Aldrich JT Baker Fermentas Roth Roth J.T. Baker Sigma-Aldrich Gibco Invitrogen Sigma-Aldrich Lonza Gibco GE Healthcare Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Fermentas Roth Roth Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Roth Roth Finnzymes Roth Sigma-Aldrich Perkin-Elmer Sigma-Aldrich Sigma
Materiale și metode 21 Trypan blue TritonX-100 0,5% tripsină + EDTA Tween20 Uree Biochrom Sigma-Aldrich Gibco Roth Sigma-Aldrich 21
Materiale și metode 22 2.1.2 Echipamente și materiale Materialele și echipamentele care nu sunt enumerate sunt echipamente standard de laborator Tabelul 3: Echipamente și materiale utilizate în această lucrare. Echipamente/materiale Criotuburi CultureSlides, 4 camere Citometru de debit FACSCalibur camere de electroforeză FUSION SL Documentație Advance Gel Cabinet Eagle Eye II GenePulser XCell Omogenizator Omni TH Immobilon PVDF Membrană Mastercycler Gradient Microplate Reader Wallac Victor microscop Cultură celulară Axiovert 40 Millipettore, Sursă de alimentare ND 1000 PowerPac NuPage geluri de poliacrilamidă ProteanXL Dimensiune ExtraThick Blot Paper Realtime PCR cycler Mx3000P Filme cu raze X Casetă cu raze X TransBlot SemiDry Blotter Tri-Carb 2900TR Vi-cell XR Flacoane de cultură pentru celule, diferite dimensiuni Vase și plăci de cultură pentru celule Centrifugă 5810R Centrifugă Biosciences BD Biosciences Biorad/Invitrogen Peqlab Stratagene Biorad Omni International Milipore Eppendorf Perkin-Elmer Zeiss Millipore Roth Nalgene Peqlab Eppendorf Biorad Invitrogen Biorad Stratagene Thermo-Scientific Rego Biorad Perkin-Elmer Beckman-Coulter Sarste dt Sarstedt Eppendorf Eppendorf Sarstedt 22
Materiale și metode 23 2.1.3 Tampoane și soluții Cu excepția cazului în care se specifică altfel, pentru preparare s-a utilizat Millipore H 2 O filtrat și soluțiile au fost depozitate la temperatura camerei (RT). "Tabelul 4: Tampoane și soluții utilizate Soluție Lucrări bacteriene Soluție de resuspendare Compoziție 50 mm Glucoză 25 mm Tris, pH 8,0 10 mm EDTA, stocare pH 8,0 la 4 C tampon de liză alcalină 0,2 N NaOH 0,5% SDS tampon de precipitare 25% 5M KAc 15% HCI TE tampon biologie moleculară 50x TAE biochimie proteică 100% acid tricloracetic (TCA ) 0,1 mm EDTA 10 mm Tris (pH 7,5) 242 g Tris bază 57,1 ml acetat 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) H 2 O și 1000 ml 40 g TCA 20 ml H 2 O 0,5 M Tris, pH 6,8 50 mm DTT 6 g Tris bază 60 ml H 2 O pH 6,8 H 2 O și 100 ml 23
Materiale și metode 24 1,5 M Tris 27,23 g Tris bază 80 ml H 2 O pH 8,8 H 2 O până la 100 ml 5x tampon de rulare SDS 360 g glicină 75 g Tris bază H 2 O și 1000 ml tampon de echilibrare 1 0,375 M Tris-HCI (ph 8,8) 6 M uree 20% glicerol (v/v) 2% SDS (g/v) 130 mm tampon de echilibrare DTT 2 0,375 M Tris-HCI (ph 8,8) 6 M uree 20% glicerol (v/v) 2% SDS (g/v) 135 mm iodoacetamidă PBST 2000 ml PBS 1 ml Tween20 uree tampon 8 M uree 2 M tiourea 2% CHAPS 50 mm DTT tampon de uscare semi-uscat 25 g SDS 5,82 g Tris bază 2,93 g glicină 1,90 ml 20% SDS 200 ml metanol H2O și 1000 ml depozitare la 4 C 24
Material și metode 25 Tampon de liză celulară (RIPA) 150 µl 1 M NaCl 50 µl 1 M Tris-HCI (ph 7,6) 50 µl 20% P40 nonident (v/v) 25 µl 10% Na deoxicolat (v/v) 10 µl inhibitor de protează și 1000 µl ciclu celular H2O, apoptoză și senescență tampon de extracție ADN 192 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 8 ml 0,1% Triton X-100 (v/v) pH 7,8 soluție de iodură de propidiu 200 µg iodură de propidiu 1 mg RNază 10 ml soluție de fixare PBS 0,25% glutaraldehidă (250 µl) 2% paraformaldehidă (1 g) PBS (pH 5,5; 50 ml) 20x cianură de potasiu (KC) 820 mg K 3 F (CN) 6 1050 mg K 4 FE (CN) 6 x 3H 2 O 25 ml PBS 40x X-GAL 40 mg 5-brom-4-clor-3-indolil β-d-galactozid 1 ml N, N-dimetilformamidă 2.1.4 Oligonucleotide Oligonucleotidele utilizate au fost Proiectat folosind software-ul Primer3 122, dacă este posibil. Proprietățile primerilor pentru recombinările omoloage (în special tendința de formare a dimerilor) au fost determinate cu software-ul Oligoanalyzer 1.2 (Freeware, T. Kuulasmaa, Universitatea din Turku, Finlanda). 25
Material și metode 26 2.1.5 Anticorpi Tabelul 5: Anticorpi primari și secundari utilizați pentru imunobloti și aplicații FACS. Sunt date proteina țintă, gazda de origine, diluția utilizată și producătorul. Producător de diluare a anticorpilor gazdă Anti-șoarece HRP ovine 1: 10000 GE Healthcare Anti-iepure HRP Capră 1: 10000 Tehnologii de semnalizare celulară Anti-eIF-5A Iepure 1: 5000 Novus Anti-DHS Rabbit 1: 1000 Santa Cruz Anti-DOHH Rabbit 1: 1000 Eurogentec Anti-p53 Rabbit 1: 1000 Santa Cruz Anti-p21 Waf1/Cip1 Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-AKT Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-pAKT Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-Rb Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-pRB Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-β-Tubulin Mouse 1: 10000 Oncogene Anti-active-Caspase3- Rabbit 1: 5 BD Pharmingen PE IgG 1 -PE Isotype Mouse 1: 5 BD Pharmingen Control 2.1.6 Medii pentru cultura celulară Tabelul 6: Medii de cultură celulară utilizate în această lucrare și compoziția lor. Soluție Gliommedium Compoziție Mediu Eagle modificat Dulbeccos 4500 mg/l glucoză L-glutamină 1 mm piruvat de sodiu 1: 100 penicilină/streptomicină 10% FCS mediu astrocitar DMEM/F-12 4500 mg/l glucoză 1 mm L-glutamină 26
Material și metode 27 1 mm piruvat de sodiu 1: 100 penicilină/streptomicină 20% FCS mediu de creștere DMEM mediu Dulbeccos modificat Eagle 4500 mg/l glucoză 1 mm L-glutamină 1: 100 penicilină/streptomicină 10% FCS (20% FCS pentru NHA) mediu de îngheț FCS 10% mediu DMSO DMEM-ES Mediul Eagle modificat de Dulbecco (25 mm HEPES) 15% FCS 2 mm L-glutamină 0,1 mM MEM 0,05 mg/ml penicilină/streptomicină amestec nucleozidic (adenozină 1,3 µg/ml; guanozină 1, 37µg/ml; citidină 1,18µg/ml; uridină 1,18µg/ml; timidină 0,38µg/ml) 1 mm piruvat de sodiu 100 µm 2-mercaptoetanol 1000 U/ml ESGRO-LIF aditiv de selecție opțional: 150 250 µg/ml G418 Mediu KSOM/HEPES, pH 7,4 95 mm NaCl 2,5 mm KCl 350 µm KH4PO4 200 µm Mediu MgSO 4 pentru MEF (celule de alimentare) DMEM 9% FBS 0,1 mm NEAA 50 U penicilină/50 µg/ml streptomicină Mediu de celule stem embrionare 27
Materiale și metode 28 DMEM 25 mm HEPES 15% FBS 2 mm L-glutamină 0,1 mm NEAA 50 U penicilină/50 µg/ml streptomicină amestec nucleozidic (1,3 µg/ml adenozină; 1,37 µg/ml guanozină; 1, 18 µg/ml citidină; 1,18 µg/ml uridină; 0,38 µg/ml timidină) 1 mm piruvat de sodiu 100 µm β-mercaptoetanol 1000 U/ml ESGRO-LIF 28
Material și metode 29 2.1.7 Celule utilizate Liniile celulare și celulele primare utilizate în această lucrare sunt enumerate în Tabelul 7. Fibroblastele embrionare murine primare (MEF) au fost, de asemenea, utilizate ca celule alimentatoare pentru cultivarea celulelor ES. Tabelul 7: Liniile celulare utilizate în această lucrare, precum și mediul lor nutritiv și originea. Linie celulară sursă medie Phoenix Eco ϕ - (HEK293T modificat, transfectat stabil cu două plasmide care codifică secvențele de virus MML pentru „gag”, „pol” și „env”.) DMEM Universitatea Stanford (SUA) U87-MG (Linie celulară de astrocitom uman aderent.), izolat dintr-un astrocitom de gradul IV al OMS. Mutații relevante: locus eliminat Ink4Arf) mediu Glioma ATCC (număr: HTB-14) G55T2 (linie celulară de astrocitom uman aderent, izolat dintr-un astrocitom de gradul IV al OMS. mutație punctuală în domeniul legării ADN) Gliommedium Neurochirurgie, Centrul Medical Universitar Hamburg-Eppendorf; Westphal 1994 NHA (astrocite umane normale, primare, astrocite diferențiate de țesutul cerebral uman) mediu astrocit Invitrogen (Darmstadt; N7805-100) C57BL/6N JM8.F6 celule (celule stem embrionare murine) DMEM-ES mediu W. Skarnes, Wellcome Trust Sanger Institute, California, SUA 29
Material și metode Au fost utilizate 36 geluri de poliacrilamidă SDS-Pagina 12% pentru separarea electroforetică a proteinelor. Plăcile de sticlă au fost plasate în suportul de turnare și gelul de separare (10 ml) a fost amestecat din următoarele soluții: 3,35 ml H2O 4 ml 30% acrilamidă 2,5 ml 1,5M Tris-HCI (pH 8,8) 50 pl 20% SDS 50 μl 10% APS 10 μl TEMED Amestecul a fost turnat între plăcile de sticlă și acoperit cu 1 ml de izopropanol până când s-a polimerizat după aproximativ 20 de minute. Gelul de colectare (4%, 5 ml) a fost alcătuit între timp: 3,05 ml H2O 0,66 ml 30% acrilamidă 1,25 ml 0,5M Tris-HCI (pH 6,8) 25 μl 20% SDS 5 μl TEMED După îndepărtarea izopropanolului și spălarea gelului de separare cu apă, gelul de colectare a fost turnat pe gelul de separare și a fost introdus pieptenele de buzunar (10 buzunare, grosime de 1,5 mm). După 20, gelul a fost plasat în camera de rulare și acesta a fost umplut cu tampon de rulare. Prepararea probei 5x tampon de încărcare și 20x agent de denaturare (ambele din Fermentas, St. Leon-Roth) au fost amestecate cu volumul dorit de lizat proteic și completate până la volumul dorit (10 50 μl) cu tampon RIPA. Amestecul a fost fiert timp de 5 minute la 95 ° C pentru a denatura proteinele și apoi a fost depozitat pe gheață. 36
Rezultate 73 AB greutate corporală [g] 30 28 26 24 22 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 20 1 3 5 8 10 12 15 17 C 1,0 zile greutatea tumorii [g] 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 Fig.: 20 Secvența de testare a experimentelor de xenogrefă in vivo și efectul GC7 într-un model de xenogrefă in vivo G55T2 asupra greutății animalelor și a masei tumorale. (A) Secvența de test a experimentelor in vivo de xenogrefă cu celule G55T2. Celulele G55T2 au fost injectate subcutanat dorsal la șoareci NSG. După creșterea cu succes și formarea tumorii, GC7 a fost administrat i.p. zilnic. administrat. După șapte zile de tratament, tumorile au fost preparate, cântărite, măsurate și conservate pentru extracția proteinelor/colorare imunohistochimică. Starea hipusinei (și, prin urmare, efectul GC7) a fost determinată prin intermediul Western blot 2D (B) Cursul greutății corporale a șoarecilor NSG după injectarea subcutanată a celulelor G55T2 și tratamentul zilnic cu 0,1 mg, 0,15 mg, 0, 2 mg GC7 sau PBS ca martor al solventului (medie ± SEM). (C) greutatea tumorii după 7 zile de tratament cu GC7. (Greutatea tumorilor individuale și media/cohorta ± SEM). Tratament vizibil (de exemplu, blană de păr, zone frământate). BehaV 73, de asemenea
Rezultate 75 3.3 Crearea unui șoarece knockout eif5a2 3.3.1 Crearea construcției țintă eif5a2 Pe baza informațiilor secvenței genei eif5a2 (numele omologului murin la gena umană eif-5a), a fost selectată o strategie de clonare și regiunea secvenței care trebuie ștearsă. Această zonă include exonii 1 3 și se închide Fig.: 22 Reprezentarea schematică a subclonării prin recombinare omoloagă. Un vector minimal liniar (negru) cu regiuni omoloage (albastru) la BAC este electroporat într-o clonă de E. coli care poartă un BAC cu segmentul ADN care urmează să fie modificat (gri). astfel începe translația și lizina 50 în exonul 2, care aduce modificarea critică a hipuzinei. Așa cum este descris în secțiunea 1.2.7, BAC RP23-361F2 servește ca punct de plecare pentru clonarea constructului vector. A fost utilizată aici metoda de recombinare (clonarea prin recombinare omoloagă) (prezentată ca exemplu în Fig.: 22). Integritatea genei eif5a2 în BAC a fost confirmată mai întâi prin secvențiere. Vectorul minim pstartk a fost apoi amplificat printr-o PCR și, prin intermediul primerilor, s-au adăugat brațe de omologie localizate 5 și 3 ale genei eif5a2. Produsul PCR a fost analizat prin electroforeză pe gel de agaroză 75
Publicații și prezentări de postere create în timpul acestei lucrări 101 Rețea completă de interacțiune proteică a modificării hipuzinei legate de cancer. Sievert H, Venz S, Platas Barradas O, Schaletzky M, Preukschas M, Bokemeyer C, Pörtner R, Walther R, Balabanov S (2011): EMBO Conference Cancer Proteomics 2011 Prezentare poster Un fenotip secretor asociat telomerilor (TASP) cooperează cu BCR- ABL pentru a conduce proliferarea malignă a celulelor stem hematopoietice murine Melanie Braig, Nora Pällmann, Michael Preukschas, Doris Steinemann, Anne Gompf, Karl L. Rudolph, Andreas Schuppert, Stefan Balabanov și Tim H. Brümmendorf Prezentare poster în pregătire 101
Anexa 115 8 Anexa2 8.1 Secvențe de grund ef5a2 construcție knockout: Nume grund de secvențiere eif5a2 în pstartk pstartrev-seq1-r pstart-k Seq fwd Grund pentru adăugarea de brațe de omologie la eif5a2 sau la casetele de rezistență A2 grund A2 grund2 eif5a2 -pentru eif5a2-kanneo-loxp-rev eif5a2-kanneo-frt-f eif5a2-kanneo-frt-r probe primer 3'-probe3-f 3'-probe3-f Primeri de secvențiere ulterioare pws-tk6-ori-f A2-TK6-Ori -r A2-A2 TK6-3'-f-r-TK6-3' secvența (5'-3 „) tgacagcagacgtgcactgg CTC GGG CCC CAA ATA ATG AT gagcccctcctgtacagcctgggtgttggtgaagggggaatccaagagttacgc GTcgactgaattggttcctttaaagc gagacagacgagttaaggagatacaagaggaaagaaggaagatggaggaa gccgcactcgagatatctagaccca aactgaagatgaggatgcatctcgcccgggaacactgcgaagcttcaaacaattaa ccctcactaaagggcg gtgctgcggattagtgcacttccggcgtgcagagctgcctgcagtcgacttaatacga ctcactatagggctc CTAGGGCCGGCCATTAATaattaaccctcactaaag CTAGTTAATTAAAAGCTTGTTAACtaatacgactcactatag cacacattacatgaattataagg ctgtcccagctcttaactgc gtgagcgaggaagcggaatatatc catccgtcagtctagtaatttcc gggaaatg 115. tggattgctgtc tataaacccgcagtagcgtg 115