Producția de cultură pură - stagiu microbiologic
-
Experimentul D1: Obținerea culturilor pure folosind frotiuri de diluare
În acest experiment, diferite tehnici ale frotiului de diluare (metoda frotiului cu 13 linii și 3 bucle) trebuie aplicate și testate în scopul obținerii culturilor microbiene pure.
Metoda cu 3 bucle:
Și aici, bucla de inoculare este recoacută și răcită la marginea plăcii care urmează a fi inoculată înainte de preluarea unui inocul din proba care urmează a fi diluată. Bucla de inoculare cu inoculul este plasată ușor pe agar și apoi se întinde de la margine la margine, dar fără a o atinge, într-o „mișcare în zigzag” până la aproximativ o treime până la jumătate din placă. Bucla de inoculare este recocită din nou, răcită, vasul Petri rotit cu aproximativ 90 ° și apoi frotiul aplicat astfel încât materialul să fie plasat în spatele primului frotiu, materialul este preluat de acesta prin glisare peste el și acest material este trecut prin placă se distribuie o altă „mișcare în zig-zag”. Bucla de inoculare este recocită din nou, răcită, vasul Petri rotit cu aproximativ 90 ° și aplicat un al treilea frotiu, analog procedurii pentru al doilea frotiu. Următoarea schiță este destinată să ilustreze din nou tehnica liniei cu 3 ochiuri:
1 săptămână
În acest experiment, o cultură mixtă de Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens și Rhodotorula glutinis cu două metode diferite de frotiu, metoda cu 13 linii și metoda cu trei bucle, pe trei medii de cultură diferite (agar HPG, KB și YGC), se efectuează frotiuri fracționate. În acest scop, plăcile de agar deja turnate și gata de utilizare au fost etichetate mai întâi pe partea inferioară a vaselor Petri.
Mediul nutritiv a avut următoarea compoziție:
Agar HPG
pentru 1000 ml aqua demin. au fost adaugate:
- 5,0 g extract de drojdie
- 5,0 g peptonă din carne
- 0,25 g glucoză
- 15 g agar
Agar YGC
pentru 1000 ml aqua demin. au fost adaugate:
- 5,0 g extract de drojdie
- 20,0 g glucoză D (+)
- 0,1 g cloramfenicol
- 14,9 g agar
Agar King B (KB)
pentru 1000 ml aqua demin. au fost adaugate:
- 20,0 g protează peptonă
- 10,0 g glicerină (pură)
- 1,5 g sulfat de magneziu (MgSO4)
- 1,8 g fosfat tri-potasic 3-hidrat (K3PO4 × H2)
- 15,0 g agar
Din fiecare dintre plăcile de agar enumerate, una a fost inoculată folosind metoda de 13 linii și una folosind metoda de trei linii, astfel încât s-au obținut 6 plăci de agar. În acest scop, suspensia celulară prevăzută cu cultura mixtă de Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens și Rhodotorula glutinis Se amestecă bine cu mixerul pentru eprubetă, apoi se răcește bucla de inoculare recoaptă pe marginea plăcii de agar KB și se ia un inocul din suspensie și se aplică pe placa de agar folosind metoda de 13 linii. Agar HPG și agar YGC au fost, de asemenea, inoculate cu un inocul din cultura mixtă utilizând metoda cu 13 linii. Cultura mixtă a fost apoi frotiată utilizând metoda frotiului cu 3 bucle, agarul KB, YGC și HPG fiind inoculat unul după altul cu bucla de inoculare. Plăcile de agar inoculate au fost acum incubate cu susul în jos: plăcile HPG timp de 2 zile la 25 ° C, plăcile YGC la 25 ° C timp de aproximativ 5 zile și plăcile KB la 25 ° C timp de 3 zile.
3 săptămâni
În a treia săptămână, s-a efectuat controlul frotiurilor din seria frotiurilor, acordându-se din nou atenție omogenității, izolării și caracteristicilor morfologice ale coloniilor, precum și contaminării.
În etapa următoare o cultură pură a Pseudomonas fluorescens câte o cultură agar înclinată și câte o criocultură pregătită.
Tubul înclinat furnizat a fost umplut cu agar HPG (compoziția a se vedea mai sus) și criomediul a avut următoarea compoziție:
Criomediu
- 0,5 ml soluție nutritivă
- 0,5 ml de glicerină 85%
- 3 mărgele de sticlă (din rechizite)
Mediu nutritiv
pentru 1000 ml aqua demin. au fost adaugate:
- 5,0 g peptonă de carne
- 3,0 g extract de carne
A 5-a săptămână
În a cincea săptămână, toate plăcile au fost examinate macroscopic și verificate pentru puritate, omogenitate și contaminare. Toate plăcile de agar au fost, de asemenea, examinate pentru fluorescență sub lampa UV (366 nm). O parte din materialul celular a fost suspendat din frotiul crioculturii pe agar HPG și un inocul al acestuia a fost aplicat pe o lamă de microscop curățată și acest frotiu, după uscare, a fost mărit microscopic de 400 de ori în câmp luminos (vezi a 4-a săptămână). Placa de agar KB din frotiul culturii de agar înclinate și placa de agar HPG din criocultură au fost puse deoparte și utilizate pentru testul catalazei în experimentul D2.
2 saptamani
Creșterea microorganismelor individuale s-a dezvoltat diferit: agarul YGC a fost predominant cu Rhodotorula glutinis, agarul KB predominant cu Pseudomonas fluorescens iar agarul HPG în mare parte cu Bacilus subtilis prea mare.
Controlul frotiului plăcilor de agar HPG, YGC și KB în metoda cu 3 bucle și 13 linii a produs rezultatele prezentate în următoarele tabele:
| +: contaminare -: fără contaminare Nume de familie: Numele contaminantului | |||
| Metoda cu 13 linii: | + | P. fluorescens | + |
| Frotiu cu 3 bucle: | - | + | - |
Rezultatele caracterizării morfologiei coloniei sunt prezentate în tabelul următor:
| YGC: Rhodotorula glutinis | roșu | 1-2 mm | rundă | neted | convex | netedă, strălucitoare | untos | - |
| KB: Pseudomonas fluorescens | alb | 1-4 mm | rundă | neted | apartament | stare brută | asemănător gelului | - |
| HPG: Bacilus subtilis | alb | 1-2 mm | rundă | neted | convex | netedă, strălucitoare | slab | - |
3 săptămâni
Controlul frotiului celui de-al doilea frotiu de diluare pe agar HPG a dat următorul rezultat:
Rhodotorula glutinis: contaminat (contaminant Rhizobium Spori), o bună izolare a coloniilor
Pseudomonas fluorescens: contaminat (contaminant Rhizobium Spori), fără izolarea coloniilor
Bacillus subtilis: fără contaminare, bună izolare a coloniilor
A 4-a săptămână
Verificarea purității culturii înclinate a agarului Pseudomonas fluorescens a dat următorul rezultat:
Fluorescenţă: Bine
Omogenitate macroscopică: Bine
Omogenitate microscopică: Bine
A 5-a săptămână
Controlul frotiului crioculturii și culturii înclinate a Pseudomonas fluorescens Agarul KB și HPG a dat următorul rezultat:
Inclinație agar KB: fluorescent, omogen macroscopic, fără contaminare
Inclinația de agar HPG: fluorescent, omogen macroscopic, fără contaminare
KB crio: fluorescent, omogen macroscopic, contaminat cu RhizobiumCrio HPG: fluorescent, macroscopic și microscopic omogen, fără contaminare
S-a constatat, de asemenea, că culoarea galbenă a coloniilor a fost mai pronunțată pe agar KB decât pe agar HPG. Creșterea pe plăcile de criocultură a fost, de asemenea, mai puternică decât pe frotiurile de cultură înclinate de agar.
Factură:
Pentru glicerină (C3H8O3) s-a dat o masă de 10 g.
Masa molară a C3H8O3 rezultă din:
(12u * 3) + (16u * 3) + (1u * 8) = 92u 92 g/mol
Masa de 10 g la 1 l are ca rezultat o concentrație molară de:
10 g/92 g/mol = 0,1086 mol/litru
Pentru fosfatul tri-potasic-3-hidrat (K3PO4 x 3 H2O) s-a dat o masă de 1,8 g la 1000 ml.
Masa molară a K3PO4 x 3 H2O rezultă din:
(39u * 3) + (31u * 1) + (16u * 4) + (6u * 1) + (16u * 3) = 266u 266 g/mol
Prin urmare, masa de 1,8 g pe l corespunde unei concentrații molare de:
1,8 g/266 g/mol = 0,0677 mol/litru
Pentru sulfatul de magneziu MgS04 s-a dat o masă de 1,5 g la 1000 ml.
Masa molară a MgSO4 rezultă din:
(24.3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) = 120.3u 120,3 g/mol
Prin urmare, masa de 1,5 g pe l corespunde unei concentrații molare de:
1,5 g/120,3 g/mol = 0,0125 mol/litru
În acest experiment, activitatea catalazei diferitelor culturi bacteriene (Pseudomonas fluorescens bacterii lactice).
Oxigenul în forma sa moleculară ca moleculă de O2 are un efect toxic asupra tuturor sistemelor de celule vii datorită efectului său oxidativ și este, de asemenea, cunoscut sub numele de otravă celulară. Acest lucru se aplică și mai mult organismelor anaerobe, deoarece acestea nu folosesc oxigenul ca acceptor terminal de electroni ai lanțului respirator și, prin urmare, nu îl pot face inofensiv sub formă de apă (H2O). Activarea oxigenului poate lua 3 forme diferite, toate fiind catalizate de așa-numitele oxidaze și în care se formează următorii intermediari:
O2 + 4 e - -> O 2- + O 2- ioni oxid
O2 + 2 e - -> O2 2- ion peroxid
O2 + 1 e - -> O2 - ion superoxid
Pentru acești ioni de oxigen, ceea ce s-a găsit pentru oxigenul molecular se aplică într-o măsură și mai mare: sunt reactanți foarte reactivi care pot provoca daune de durată celulei și componentelor sale. Acesta este motivul pentru care majoritatea organismelor au sisteme enzimatice care fac ca intermediarii care rezultă din reducerea oxigenului să fie inofensivi. Ionii de oxid reacționează cu protoni pentru a forma apă, care este inofensivă pentru celulă, ionii de peroxid reacționează cu protonii H + pentru a forma peroxid de hidrogen (H2O2), care este, de asemenea, foarte reactiv și dăunător celulei. Ionul superoxid reacționează cu peroxidul de hidrogen și protonii de hidrogen pentru a forma oxigen molecular, apă și radicalul hidroxil, care la rândul său este toxic pentru celulă. Reacțiile ulterioare de activare a oxigenului sunt enumerate din nou mai jos:
Pentru a face peroxidul de hidrogen inofensiv, majoritatea organismelor aerobe au enzima catalază, care descompune H2O2 în apă și oxigen molecular:
Există, de asemenea, peroxidaze care sunt capabile să detoxifice peroxidul de hidrogen prin protonație:
Pentru a evita formarea de radicali hidroxil, organismele aerobe și aerotolerante au enzima superoxid dismutază, care transformă ionul superoxid din activarea oxigenului în peroxidul de hidrogen și oxigenul molecular puțin mai dăunător:
Organismele anaerobe au de obicei nu au aceste sisteme enzimatice.
Reacția catalazică este utilizată pentru a caracteriza microorganismele, putând observa evoluția gazului din oxigenul molecular din organismele care posedă această enzimă. Această reacție poate fi utilizată pentru a distinge între aerob și anerob și mai ales de la organismele aerotolerante. [2]
În acest experiment au fost folosite plăcile de agar alungite din frotiuri Pseudomonas fluorescens din experimentul D1 (un agar KB din cultura de agar înclinat și o placă de agar HPG din criocultură), precum și plăcile de agar din frotiurile bacteriilor lactice din experimentul H (un agar M17 cu streptococ și un agar Rogosa cu Lactobacillus) supus unui test de catalază. În acest scop, prima dintre plăcile de agar a fost așezată direct pe masa de laborator, capacul vasului Petri a fost îndepărtat și soluția de peroxid de hidrogen 3% (H2O2) disponibilă dintr-un balon mic Erlenmeyer a fost turnată peste ea, astfel încât agarul să fie acoperit uniform de lichid. A fost apoi așteptat scurt pentru a vedea dacă gazul se va dezvolta în lichidul de deasupra agarului și s-a observat rezultatul. Toate plăcile de agar au fost testate folosind același procedeu. Plăcile de agar testate au fost eliminate în deșeurile autoclavei.
Atât testul catalazei cu agar KB din înclinarea agarului, cât și agar HPG din criocultură au fost pozitive, adică O puternică evoluție a gazului ar putea fi determinată vizual, caracterizată prin spumare puternică și formarea de bule a lichidului. Ambele plăci de agar (agar M17 cu streptococ iar agarul Rogosa cu Lactobacillus) din experimentul H nu a fost detectabilă nicio evoluție a gazului.
Ca urmare a acestui experiment se poate afirma că Pseudomonas fluorescens Catalază pozitivă și, prin urmare, are enzima de protecție catalază, în timp ce bacteriile lactice streptococ și Lactobacillus Sunt catalază negativă și nu au enzima catalază. Astfel se poate Pseudomonas fluorescens clasificați ca un organism aerob și bacteriile lactice ca cel puțin organisme aerotolerante sau chiar anaerobe.
De asemenea, trebuie remarcat faptul că gazul rezultat ar putea fi, de asemenea, colectat și supus unor examinări suplimentare pentru a verifica dacă este de fapt oxigen (O2).