Reglarea hepcidinei extrahepatice dependente de fier - Descărcare gratuită PDF
1 Spitalul Universitar Ulm Centrul de Medicină Internă Clinica de Medicină Internă I Director medical: Prof. Dr. med. Thomas Seufferlein Reglarea hepcidinei extrahepatice dependente de fier Disertație Pentru obținerea titlului de doctor în stomatologie al Facultății de Medicină a Universității din Ulm prezentat de Clara Ruth Frieda Brenig din München 2013
2 Decan interimar: Prof. Dr. Thomas Wirth Reporter 1: PD Dr. Pavel Strnad 2. Raportor: prof. Dr. Ziua promoției Lars Bullinger:
4 Cuprins Cuprins Cuprins Cuprins Cuprins III V VI 1 Introducere Echilibrul fierului Expresia și structura hepcidinei Mecanismele de acțiune ale hepcidinei Reglarea hepcidinei hepatice Hepcidina în organele extrahepatice ARN din țesut cdna prima sinteză sinteză PCR cantitativă în timp real Determinarea fierului în țesut Extracția proteinelor din țesut Determinarea proteinelor Western blot Histologie și colorare Feritină serică și determinarea fierului seric Evaluare statistică I
5 Cuprins 3 Rezultate Concentrații serice de fier și feritină după dietele cu conținut scăzut de fier și fier Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și fier asupra ficatului Concentrația hepatică a fierului Expresia hepatică hepatică Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și fier asupra organelor extrahepatice Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și fier cu privire la splină Dietele cu conținut scăzut de fier și de fier pe stomac Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și de fier asupra pancreasului Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și de fier asupra rinichilor Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și de fier asupra duodenului Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și de fier asupra inimii Discuție Parametrii sistemici de fier în funcție de conținutul de fier al dietei administrate Concentrația locală de fier în organele extrahepatice în funcție de conținutul de fier al dietei administrate Expresii hepcidine ale organelor extrahepatice în funcție de dieta administrată Rezumat 53 Ref index 54 Mulțumiri 63 Curriculum Vitae 64 II
8 Lista tabelelor Lista tabelelor Tab. 1 Secvențe primare pentru analiza RT-PCR Tab. 2 Soluție standard de fier Tab. 3 Schemă de pipetare pentru prepararea gelului Tricine-SDS-Poliacrilamidă 22 Tab. 4 Anticorpi primari Tab. 5 Anticorpi secundari V
9 Listă de abrevieri Listă de abrevieri µ Micro ALK2/APS AS BMP (R) BPS BSA cdna dest DFO DMT DNA dntp DTT ECL GP 80/H 2 O HAMP Hepc1/HFE HJV IFN-γ IL-6 (R) M n NaCl activin-like receptor Kinase2/3 Persulfat de amoniu Aminoacid Os Proteină morfogenetică (receptor) Acid batofenantrolinisulfonic Disodic Sare Vițel Ser albumină ADN complementar Desferroxamină Transportor metalic divalent1 Acid desoxiribonucleic Deoxi-nucleotidă trifosfat Anticonol Receptor) clorură de nanosolar molar VI
10 Lista abrevierilor p PCR psmad qrt RNA rpm SDS SMAD STAT TBS TEMED Tf (R) TGF Tris V Pico Polimerază Reacție în lanț fosforilat SMAD Cantitativ în timp real Acid ribonucleic Runde pe minut Sodiu de sodiu Dodecil Spinal Musculare Atrofie și Mothersagainstec, N, N, N-Tetrametiletilendiamină 1,2- bis (dimetilamino) -etan transferină (receptor) Factor de creștere transformant Tris- (hidroximetil) -aminometan Volt VII
19 1 Introducere Organele, totuși, sunt în mare parte neexplorate. Diverse studii au arătat până acum că diferiți factori precum Supraîncărcarea cu fier, inflamația sau hipoxia pot influența expresiile locale de hepcidină din organele nehepatice, dar mecanismul rămâne de obicei inexplicabil. Pentru a îmbunătăți înțelegerea reglării extrahepatice a hepcidinei, prezenta lucrare de cercetare a analizat influența supraîncărcării de fier sau a deficitului de fier asupra echilibrului de fier și a expresiei hepcidinei în diferite țesuturi. În acest scop, șoarecii de tip sălbatic au fost folosiți ca sistem model și hrăniți cu diferite diete de fier. Influența acestor diete asupra expresiei hepcidinei a fost apoi examinată la nivelurile de ARN și proteine. În plus, s-a măsurat concentrația de fier în țesuturi. 9
20 2 Material și metode 2 Material și metode Toate substanțele chimice, reactivii, kiturile, materialele și dispozitivele utilizate în această lucrare sunt enumerate în următoarele liste. 2.1 Materiale chimice Acrilamidă APS (persulfat de amoniu) Acid L-ascorbic β-mercaptoetanol Acid batofenantrolin acid disulfonic sare disodică (BPS) Bisacrilamidă Albină serică bovină (BSA) Reactiv Bradford Bromofenol albastru Coomassie Deoxinucleotid trifosfat de amestec trifosfat (trifosfat) Ditiotreitol (DTT) ECL Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Bio Rad, Laboratories Gmbh, München Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg BIO-RAD Laboratories GmbH, München Sigma Aldrich Chemie GmbH, München BIO-RAD Laboratories GmbH, München PeqLab, Erlangen MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Marea Britanie 10
21 2 Material și metode Fier III Nonahidrat Nitrat Carbonat de fier Dezvoltator Eozină Etanol Soluție de fixare Formaldehidă Glicerină Glicină Hematoxilină Isopropanol Potasiu Hexacianoferat Clorură II Nuclear Rapid roșu Metanol Novex Proteină ascuțită Oligo (dT) 20-Primer Protease Inhibitor ROCA Master Mix SuperScriptIII Reverse Transcriptase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich Tentenal AG & Co KG, Norderstedt Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Munich Tetenal AG & Co KG, Norderstedt Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Munich Merck, Darmstadt Vector Laboratories, Burlingame, SUA Sigma Aldrich Chemie GmbH, Munich Dako Deutschland GmbH, Hamburg Invitrogen, Darmstadt Roche, Mannheim Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH Hilden Invitrogen GmbH, Darmstadt 11
22 2 Material și metode Acid clorhidric TEMED (N, N, N, N -Tetrametil-etilendiamină) Tris- (hidroximetil) - aminometan Tween20 xilen Acid citric monohidrat VWR International GmbH, Darmstadt Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Sigma Aldrich Chemie GmbH, München VWR, Ulm Merck KGaA, Darmstadt 12
23 2 Material și metode Loturi de reacție și soluții tampon Acid ascorbic Tampon anodic Tampon tamponare BPS Coomassie Blue solution Soluție DNază Tampon de extracție Soluție de lucru pentru colorarea fierului Tampon de încărcare gel (5x) 0,088g acid ascorbic 5ml H 2 O 24,22 g Tris ad 1L H 2 O 3,03 g 11,26g glicină 100ml metanol și 1L dist. H2O ph 8,3 14,76mg BPS 5ml H2O 400ml metanol 100ml acid etanoic 0,4g Coomassie blue 250G ad 1L dist. H 2 O 70µl RDD 10µl DNază/probă 10mM Tris 0,5% Triton X-100 ph 7,5 100ml 2% hexacianoferat de potasiu II 100ml 1% HCI 1M Tris 10% SDS 50% glicerină 25% β mercaptoetanol albastru bromofenol 375µl dist. H 2 O ph 6,8 13
24 2 Material și metode Stocare gel tampon tampon catodic Soluție standard pentru determinarea fierului Separare gel tampon T40/C3 T40/C6 Tris-buffered-saline (TBS) Tris-buffered-saline cu Tween (TBST) RLT tampon + β ME master mix pentru sinteza cdna I 60, 5g Tris la 1L dist. H 2 O ph 6,8 12,11g Tris 17,92g Tricină 10ml SDS ad 1L H 2 O 0,003607g Fier III azotat Nonahidrat 1ml H 2 O 1811,71g Tris ad 1L dist. H 2 O ph 8,8 7,76 g acrilamidă 0,24 g bisacrilamidă ad 20 ml VE-H 2 O 18,8 g acrilamidă 1,2 g bisacrilamidă ad 50 ml VE H 2 O 8,76 g NaCI 1,21 g Tris ad 1L dist. H 2 O ph 7,5 1L TBS 1ml Tween20 10µl 1% β mercaptoetanol 1ml RLT (parte a kitului RNeasy Mini) 1µl Oligo (dT) 20-Primer (0,2µg/µl) ARN (2µg) 1µl dntp-mix (10mM fiecare ) ad 14 µl apă fără RNază 14
25 2 Materiale și metode Master-Mix pentru cdna-synthesis II Master-Mix pentru RT-PCR Primermix Acid citric 4µl Buffer First Strand 1µl 0.1M DTT 1µl SuperScriptIII RT (200U/µl) 5µl SYBR-Mix 3µl H 2 O dest . 0,03µl primer înainte (100pmol) 0,03µl primer posterior (100pmol) și 1 ul H2O dist. 1.05g acid citric monohidrat 50 ml H 2 O kituri RNeasy Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden conține: First-Strand-Buffer RDD (RNase-free buffer) RNeasy lysis buffer RLT Rnase-free DNase RW1 RPE devices 7500 Fast Real-Time PCR System with Software: Sequence Detection Versiunea 1.5 KC4 Software de analiză a datelor Balanța analitică Applied Biosystems, Darmstadt BioTek, Bad Friedrichshall Sartorius AG, Göttingen 15
37 3 rezultatele dietei de control au fost reduse cu greu (86,9 ± 24 µg/g în grupul cu sărăcie în fier, 105,2 ± 22,6 µg/g în grupul de control. A se vedea Figura 6). Concentrația de fier în țesutul hepatic al grupului bogat în fier a fost de 5 ori mai mare decât cea a dietei de control (589,4 ± 243 µg/g în grupul bogat în fier). Figura 5: Examenul histologic al ficatului șoarecilor după o dietă cu conținut scăzut de fier, standard și bogat în fier. Țesutul hepatic care a fost colorat cu pata de albastru Berlin arată în țesutul (A) de la șoarecii care au fost hrăniți cu hrană cu un conținut scăzut de fier, în în (C) au fost hrănite cu alimente bogate în fier. La șoarecii cărora li s-a administrat o dietă bogată în fier, se poate observa acumularea semnificativă de fier periportal (săgeată). Mărire: concentrația de fier de 20 de ori (µg/g) p = 0, EA ST ER Figura 6: Concentrația de fier în țesutul hepatic al șoarecilor după o dietă scăzută de fier, standard și bogată în fier Concentrația de fier în ficatul șoarecilor după 5 săptămâni de fier scăzut (EA), standard ( ST) și dietă bogată în fier (ER) de 4 săptămâni. Sunt prezentate valorile medii a cel puțin 5 șoareci pe grupă. Expresia hepcidinei hepatice Expresia hepcidin1 și hepcidin2 a șoarecilor hrăniți săraci a fost semnificativ redusă comparativ cu dieta martor (hepcidin1: p = 0,001; hecidin2: 27
40 3 Rezultate 400 Concentrația de fier (µg/g) p = 0, p = 0,03 0 EA ST ER Figura 9: Concentrația de fier în țesutul splinei șoarecilor după o dietă scăzută de fier, standard și bogată în fier Concentrația de fier în splina șoarecilor după 5 săptămâni de fier scăzut (EA), standard (ST) și dietă bogată în fier (ER) de 4 săptămâni. Sunt prezentate valorile medii de cel puțin 5 șoareci per grup. AB 6 5 Expresia hepcidin1 relativ la ß-actină p = 0,03 p = 0,05 Expresia hepcidin2 relativ la ß-actina EA ST ER 0 EA ST ER Figura 10: Expresia mrna a hepcidinei în splină la șoareci cu niveluri scăzute de fier, Dieta standard și bogată în fier (A) Hepcidin1 și (B) Hepcidin2 expresie relativă la expresia β-actinei în splină la șoareci după o dietă săracă în fier (EA), dietă standard (ST) și dietă bogată în fier (ER) cuantificată prin RT -PCR. Rezultatele sunt raportate ca mijloace de cel puțin 5 șoareci per grup ± deviație standard. Valorile sunt valori relative care au fost normalizate în raport cu controlul (= 1). 30
42 3 Rezultate A B C Figura 12: Examinarea histologică a țesutului stomacal al șoarecilor cu o dietă cu conținut scăzut de fier, standard și bogat în fier colorarea albastră a corpului la șoareci (A) după hrănirea cu fier scăzut, (B) grupul de control, (C) grupul bogat în fier. Acumulările exemplare de fier în celulele principale ale dietei de control și ale celei bogate în fier sunt marcate cu o săgeată. Mărire: de 20 de ori. analiza tern blot și RT-PCR cantitativă efectuate. În analiza proteinelor, anticorpii împotriva STAT3 și forma activă a STAT3, pstat3, au prezentat o bandă la 70kDa (vezi Figura 15). Cu toate acestea, datorită intensității constante a benzii, ancheta nu a dezvăluit nicio dovadă a creșterii producției STAT3. În plus, expresia IL-6 a fost măsurată utilizând RT-PCR cantitativ. Datorită nivelurilor de expresie extrem de scăzute, s-a arătat că nu a existat inflamație (2,3 ± 1,6 în grupul săracă în fier, 1 ± 0,5 în grupul martor, 2,4 în grupul bogat în fier, vezi Figura 16). 32
43 3 Rezultate Concentrația de fier 600 (µg/g) p = 0,007 0 EA ST ER Figura 13: Modificarea concentrației de fier în corpusul șoarecilor după o dietă scăzută de fier, standard și bogată în fier Concentrația de fier în corpusul șoarecilor după 5 săptămâni de fier scăzut (EA), standard - (ST) și dietă bogată în fier (ER) de 4 săptămâni. Șoarecii cărora li s-a administrat chow-ul standard au servit drept controale. Sunt prezentate valorile medii a cel puțin 5 șoareci per grup. AB 20 1,5 Expresia hepcidin1 relativă la ß-actină p = 0,03 Expresia hepcidin2 relativă la ß-actina 1 0,5 p = 0,04 0 EA ST ER 0 EA ST ER Figura 14: expresia mrna im Corpus de șoareci după o dietă cu conținut scăzut de fier, standard și bogat în fier (A) Expresia hepcidin1 și (B) Hepcidin2 relativă la expresia β-actinei în corpusul șoarecilor după o dietă scăzută în fier (EA), dietă standard (ST) și dietă bogată în fier (ER) cuantificat printr-un RT-PCR. Rezultatele sunt raportate ca medii ± deviație standard. Valorile sunt valori relative care au fost normalizate în raport cu controlul (= 1). 33
44 3 Rezultate ficat cu nivel scăzut de fier ficat ridicat cu fier PosKont pstat3 STAT3 ß-tubulină Figura 15: Expresia proteinelor de STAT3/pSTAT3 la șoareci după o dietă scăzută în fier, standard și bogată în fier Analiza Western blot a țesutului stomacal al șoarecilor după o dietă scăzută în fier, standard și bogată în fier. Anticorpi: pstat3 (traductoare de fosfosemnal și activator de transcripție-proteină), STAT3 (traductoare de semnal și activator de transcripție-proteină). Ficatul PosKont corespunde controlului hepatic pozitiv. β-tubulina a fost utilizată ca control de încărcare. 5 Expresia IL-6 în raport cu ß-actina p = 0,01 0 EA ST ER Figura 16: expresia mrna în corpusul șoarecilor după o dietă scăzută în fier, standard și bogată în fier Expresia interleukinei-6 (IL-6) în raport cu β-actina Expresie în corpus la șoareci după o dietă cu conținut scăzut de fier (EA), dietă standard (ST) și dietă bogată în fier (ER) cuantificată prin RT-PCR. Rezultatele sunt raportate ca mijloace de cel puțin 5 șoareci per grup ± deviație standard. Valorile sunt valori relative care au fost normalizate în raport cu controlul (= 1). 34
46 3 Rezultate 25 Concentrația de fier [! G/g] EA ST ER Figura 18: Concentrația de fier a pancreasului șoarecilor după o dietă scăzută în fier, standard și bogată în fier Concentrația de fier în pancreasul șoarecilor după 5 săptămâni de fier scăzut (EA), standard (ST) și Dieta de 4 săptămâni bogată în fier (ER). Șoarecii cărora li s-a dat chow-ul standard au servit drept controale. Sunt prezentate valorile medii de cel puțin 5 șoareci per grup. AB 2 2 Expresia hepcidinei 1 față de ß-actină 1 Expresia hepcidinei 2 față de ß-actina 1 p = 0,03 0 EA ST ER 0 EA ST ER Figura 19: Expresia mrna pancreatică la șoareci săraci în fier, standard și ferici Dieta (A) Hepcidin1 și (B) Hepcidin2 expresie relativă la expresia β-actinei în pancreas la șoareci după o dietă săracă în fier (EA), dietă standard (ST) și dietă bogată în fier (ER) cuantificată prin RT-PCR. Rezultatele sunt raportate ca mijloace de cel puțin 5 șoareci per grup ± deviație standard. Valorile sunt valori relative care au fost normalizate în raport cu controlul (= 1). 36
48 3 Rezultate 300 Concentrație de fier [! G/g] EA ST ER Figura 21: Concentrația de fier în rinichi la șoareci după o dietă scăzută în fier, standard și bogată în fier Concentrația de fier în rinichii șoarecilor după 5 săptămâni de fier scăzut (EA), standard (ST ) și dietă bogată în fier (ER) de 4 săptămâni. Șoarecii cărora li s-a administrat chow-ul standard au servit drept controale. Sunt prezentate valorile medii de cel puțin 5 șoareci per grup. AB Expresia Hepcidin1 relativă la ß-actină Expresia Hepcidin2 relativă la ß-actina EA ST ER 0 EA ST ER Figura 22: Expresii mrna ale hepcidinei la rinichi la șoareci după o dietă săracă în fier, standard și bogată în fier (A) Hepcidin1 și (B ) Expresia hepcidin2 relativă la expresia β-actinei la rinichi la șoareci după o dietă săracă în fier (EA), dietă standard (ST) și dietă bogată în fier (ER) cuantificată prin RT-PCR. Rezultatele sunt raportate ca mijloace de cel puțin 5 șoareci per grup ± deviație standard. Valorile sunt valori relative care au fost normalizate în raport cu controlul (= 1). 38
50 3 Rezultate 400 Concentrație de fier [! G/g] p = 0, EA ST ER Figura 24: Concentrația de fier în duoden la șoareci după o dietă cu conținut scăzut de fier, standard și bogat în fier Concentrația de fier în duoden la șoareci după 5 săptămâni de fier scăzut (EA), standard (ST) și dieta de 4 săptămâni bogată în fier (ER). Șoarecii cărora li s-a administrat hrana standard au servit drept controale. Sunt prezentate valorile medii de cel puțin 5 șoareci per grup. AB 4 2 Expresia hepcidinei 1 față de ß-actină Expresia hepcidinei 2 față de ß-actina 1 0 EA ST ER 0 EA ST ER Figura 25: Expresia mrna a hepcidinei în duoden la șoareci după o dietă săracă în fier, standard și bogată în fier (A) Expresia Hepcidin1 și (B) Hepcidin2 relativă la expresia β-actinei în duoden la șoareci după o dietă săracă în fier (EA), dietă standard (ST) și dietă bogată în fier (ER) cuantificată prin RT-PCR. Rezultatele sunt raportate ca mijloace de cel puțin 5 șoareci per grup ± deviație standard. Valorile sunt valori relative care au fost normalizate în raport cu controlul (= 1). 40
51 3 Rezultate Efectul dietelor cu conținut scăzut de fier și de fier asupra inimii Nu s-au găsit modificări histologice sau acumulări de fier în inimă (vezi Figura 26). Concentrația de fier din inimă corespunde cu 10% din concentrația de fier din ficat. Modificările dintre dieta cu conținut scăzut de fier și dieta martor nu pot fi observate, dar există o tendință de creștere a concentrației în dieta bogată în fier (8,5 ± 12,0 µg/g în grupul cu nivel scăzut de fier, 3,1 ± 5,7 µg/g în grupul de control, 25,7 ± 22,9µg/g în grupul bogat în fier, vezi Figura 27). În plus, nivelurile de expresie ale hepcidinei din inimă nu au prezentat nici o modificare (Hepcidin1: 1,5 ± 0,8 în grupul săracă în fier, 1 ± 0,7 în grupul martor, 2,5 ± 1,4 în grupul bogat în fier; Hepcidin2: 1,2 ± 0,3 în grupul săracă în fier, 1 ± 0,1 în grupul martor, 1,3 ± 0,3 în grupul bogat în fier). Vezi Figura 28. ABC Figura 26: Examinarea histologică a inimii șoarecilor după o dietă săracă în fier, standard și bogată în fier colorarea albastru de Berlin în inima șoarecilor după (A) hrănire cu fier scăzut, (B) hrănire standard și (C) hrănire bogată în fier . Mărire: de 20 de ori. 41