Reglarea influențată de dietă a expresiei genelor de stres oxidativ la porci - PDF
1 Reglarea influențată de dietă a expresiei genelor de stres oxidativ la porci Disertație pentru obținerea diplomei universitare doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) De la Facultatea de Matematică și Științe Naturale de la Universitatea din Rostock prezentată de Bianka Kurts-Ebert, născută. pe 19 februarie 1975 în Neindorf din Klingendorf Rostock,
2 2 Recenzant: Prof. Dr. Manfred Schwerin Research Institute for the Biology of Farm Animals (FBN) Executive Board/Department of Functional Genome Analysis Wilhelm-Stahl-Allee Dummerstorf Prof. Dr. Edda Siegl Universitatea din Rostock Departamentul de Biologie Inst. F. Biologie celulară și tehnologia biosistemelor Departamentul de genetică/imunobiologie Albert-Einstein-Str Rostock Data apărării: 14 ianuarie 2007
3 CUPRINS Lista abrevierilor Lista figurilor Lista tabelelor Introducere Stadiul cercetării Impactul nutrițional asupra metabolizării și sănătății Programarea metabolică prenatală Programarea metabolică precoce postnatală Cauzele modificărilor persistente fiziologice și metabolice Capacitatea ereditară a programării metabolice Metilarea ADN Posibil mecanism de programare metabolică Metilarea ADN Funcția ADN Metiltransferazelor Mecanismul inactivării genelor prin modelarea cromatinei Metilarea ADN-ului ca posibil mecanism molecular pentru efectele metabolice persistente legate de dietă Sarcină Material și metode Abordare experimentală: Diete și animale Izolarea acizilor nucleici Izolarea ARN Izolarea ADN genomic
5 Cuprins 5 6. Discuție Modificări de lungă durată asociate dietei în răspunsul la stresul oxidativ Metilarea ADN - mecanismul modificărilor persistente ale expresiei genei Sumar Bibliografie Anexa 149 A. Surse de aprovizionare A.1 Echipamente A.2 Substanțe biologice, substanțe chimice, soluții și tampoane
7 LISTA ABREVIERILOR AARE Element de răspuns la aminoacizi Acetilare AC Acc. Nr. De acces AP1 Activator Proteina 1 BHMT bp Betaină-Homocisteină-Metiltransferază Perechi de bază CAS CANX cdna CpG Caseină Calnexin Copie Acid dezoxiribonucleic Citozină-fosfatidil-guanozină ddh2o apă dublă distilată ddntp dideoxiribonuclic -Metiltransferază dpm puncte pe minut dntp (datp, dctp, dezoxiribonucleozid-5-trifosfat dgtp, dttp) (A = adenozină, C = citozină, G = guanozină, T = timidină) DTT ditiotreitol [3H] dctp 5-deoxicit sare tetrasodică, [5,5 3H] tetraacetat de etilendiamină EDTA
8 8 Lista abrevierilor FBN FDR FP Institutul de Cercetare pentru Biologia Animalelor de Fermă Fals Rata de descoperire Perioada de hrănire GSTA1 GR Glutation-S-Transferază A1 Glucocorticoid Receptor HDAC Histonă Deacetilază HDL Densitate mare Lipoproteină HMT Histonă Metiltransferază HP1 Șoc ICF Transcripție HSF Căldură 1 Imunodeficiență Regiune centromerică Instabilitate și anomalii faciale Factor de creștere asemănător insulinei kb Kilobază (n) LB LDL LT Luria Bertani Lipoproteine cu densitate scăzută Zile de viață MBD MeCP mrna MS MSRA MTF 5MTHF Domeniu de legare a metilului Metil-CpG-legare Proteine Metină Messon Ribonucle Reductază A metiltransferază 5metil tetrahidrofolat NfκB Factor nuclear κb
9 Lista abrevierilor 9 OATP2 Organice de transport anionic Polipeptidă 2 PAC PCR P1 Cromozom artificial Polimerază Reacție în lanț Repr. ROS rpm RT Represor al CAR1- Factor reactiv Oxigen Specii runde pe minut Transcriere inversă SAM S-adenosilmetionină SP1 Specificitate proteină SPI proteină de soia TF SPI proteină de soia N, N, N Tetrametiletilendiamină Factor de transcripție Tris- (hidroximetil) -aminometan USF URS Element de răspuns în amonte Secvență de reprimare în amonte Secvență YAC Cromozom artificial Drojdie
10 10 Lista abrevierilor
11 LISTA CIFRELOR 2.1 Influența nutriției materne asupra dezvoltării fetale și efectele asupra bolilor în faza post-reproductivă a vieții Modificări fiziologice care conduc la programarea metabolică și boli în faza post-reproductivă a vieții Stresul oxidativ - un mecanism potențial pentru modificări metabolice pe termen lung legate de nutriție Metilarea citozinei Procesul de metilare a ADN-ului Metabolizarea grupului de metil Conținut de aminoacizi de proteine în dietele experimentale CAS și SPI Diete și animale Exemplu de curbă de temperatură de topire bimodală Reprezentarea schematică a secvențierii ADN genomic modificat cu bisulfit Catenele ADN nu mai sunt complementare după tratamentul cu bisulfit Secvența chimică a dezaminării hidrolitice induse de bisulfit a citozinei la uracil Principiul Pirosecvențiere Pirogramă Greutatea medie (kg) a animalelor din grupul respectiv de hrănire înainte de începerea F studiu de hrănire și după perioadele individuale de hrănire Nivelurile de transcripție hepatică a genelor răspunsului la stres oxidativ după patru săptămâni de hrănire cu dieta SPI cu trecerea ulterioară la dieta CAS în comparație cu grupul de control CAS
13 LISTA TABELELOR 2.1 Efectele unei restricții ontogenetice de proteine timpurii Dezvoltarea și modificările specifice țesutului în metilare și influența lor asupra expresiei Sindroame și cancere cauzate de disfuncționalități de metilare în mecanismul de imprimare Exemple de dezvoltare a tumorii datorită hipermetilării ADN și inactivării asociate a tumorilor - Ciclul PCR al genei supresoare pentru secvențierea cu ciclul PCR LICOR LightCycler Ciclul PCR pentru amplificarea ciclului PCR de 5 curse pentru amplificarea ADN-ului tratat cu bisulfit Izolarea clonelor GSTA1-PAC Grunduri utilizate pentru măsurarea ratelor de transcripție Grunduri utilizate pentru secvențierea zonei 5-netraduse. Grunduri utilizate pentru amplificarea produselor PCR. Grunduri utilizate pentru secvențierea siturilor de metilare. Grunduri utilizate pentru identificarea zonei 5-netraduse. Corelație coeficienți din nivelul de transcripție hepatică al genelor examinate și masa corporală a porcilor. 76
14 14 Lista tabelelor
21 2.1. Impactul nutrițional asupra metabolismului și sănătății 21 Fig. 2.2: Modificări fiziologice care pot duce la programare metabolică și boli în faza postreproductivă a vieții. Malnutriția pre- și precoce postnatală poate duce la modificări ale concentrațiilor hormonale, ceea ce poate duce la adaptări metabolice permanente. Fenomenul efectelor fiziologice pe termen lung asociate dietei asigură supraviețuirea în condiții nutriționale nefavorabile, deși programarea poate avea efecte negative asupra sănătății în faza postreproductivă a vieții [9, 44].
24 24 2. Stadiul cercetării Fig. 2.3: Stresul oxidativ - un mecanism potențial pentru modificările metabolice pe termen lung legate de dietă. O dietă bazată pe proteine din soia (SPI), care se caracterizează printr-un conținut dezechilibrat de aminoacizi, determină o expresie crescută a genelor oxidative în ficatul porcilor în creștere. Răspunsul la stres datorat inducerii stresului oxidativ [25, 51, 95].
31 2.2. Metilare ADN: posibil mecanism de programare metabolică 31 Tab. 2.4: Exemple de dezvoltare tumorală prin hipermetilare ADN și inactivarea asociată a genelor supresoare tumorale Supresoare tumorale Tipuri de tumori Ref. P16 Carcinom oral [185] p57kip2 u.brustkrebs [186] RASSF1A gliom carcinogen, cancer mamar [187, 188] carcinom cu celule renale [189] p16/rassf1a/hmhl1 intra- și extrahepatic [190] GSTP colangiocarcinom APC cancer mamar [188] DAP kinază cancer mamar [191] hdab2ip ] Runx3 cancer de colon [192] EXT1 leucemie, cancer de piele [193] PTEN cancer de sân [194] LOX cancer de stomac [195] Fig. 2.4: Metilarea citozinei ADN metil transferaza catalizează transferul grupării metil la citozină. Se formează 5-metilcitozină.