SEMNIFICAȚIA MOUSEULUI NLRC5 KNOCK OUT ÎN DIFERITE MODELE DE INFLAMARE ÎN CONBATE

Clinica de Medicină Internă I (Director: Prof. Dr. Stefan Schreiber) în Centrul Medical al Universității Schleswig-Holstein, Campus Kiel la Universitatea Christian Albrechts din Kiel Facultatea Christian-Albrechts-Universität zu Kiel prezentată de NICOLINA LARA BÖTTCHER din Kiel Kiel 2012

nlrc5

1. Raportor: Prof. Dr. Rosenstiel al doilea reporter: Prof. Dr. Ziua Grassl a examenului oral: 18 decembrie 2013 Aprobat pentru tipărire, Kiel, 13 noiembrie 2013 semnat Prof. Dr. Laude

Prin prezenta declar că disertația pe tema Semnificația mouse-ului Nlrc5 Knock-Out în diferite modele de inflamație a sistemului imunitar înnăscut, în afară de sfaturile conducătorului meu de doctorat și ale celorlalți profesori ai mei academici, este propria mea lucrare în ceea ce privește forma și conținutul și că, în afară de cele din Nu am folosit alte ajutoare enumerate în teză. Am marcat toate pasajele literale sau legate de conținut ca atare. Afirm, de asemenea, că am depus disertația atașată doar în această și în nicio altă procedură de doctorat și că această procedură de doctorat nu a fost precedată de nicio procedură de doctorat în cele din urmă eșuată. Locul, data, semnătura

i Cuprins Lista abrevierilor și termenilor tehnici. iii Lista figurilor. v Lista tabelelor. v 1 introducere. 1 1.1 Boala inflamatorie a intestinului. 1 1.2 Studii de asociere genetică în domeniul bolilor inflamatorii cronice. 3 1.3 Boli autoinflamatorii. 4 1.4 Sistemul imunitar înnăscut și receptorul de recunoaștere a modelelor. 5 1.4.1 Asocieri genetice ale familiei de receptori asemănători nodului cu boli inflamatorii cronice. 7 1.4.2 Familia receptorilor de tip Nod. 8 1.5 Număr. 11 2 Material și metode. 13 2.1 Material. 13 2.2 Șoareci. 13 2.3 Experimente cu șoareci. 14 2.3.1 Pregătirea șoarecilor. 14 2.3.2 Șoc endotoxinic. 14 2.3.3 Colita indusă de DSS. 15 2.4 Izolarea țesutului/celulelor șoarecilor. 17 2.4.1 Izolarea ADN-ului din cozile șoarecilor. 17 2.4.2 Macrofage derivate din măduva osoasă (BMDM). 17 2.4.3 Plămâni. 19 2.4.4 Stimulare. 19 2.5 Metode biologice moleculare. 20 2.5.1 Izolarea ARN-ului din țesut. 20 2.5.2 sinteza cdna. 21 2.5.3 Reacția în lanț a transcriptazei revers polimerazei (RT-PCR). 21 2.5.4 Electroforeză pe gel de agaroză. 22 2.5.5 PCR în timp real. 23 2.5.6 ELISA. 23 2.6 Metode histologice. 24 2.6.1 Pregătirea. 24 2.6.2 colorarea HE. 24 2.7 Statistici. 25 3 rezultate. 26

ii 3.1 Nlrc5. 26 3.1.1 Organizarea genomică a Nlrc5 murin. 26 3.1.2 Profilul de expresie al Nlrc5. 27 3.1.3 Reglarea Nlrc5 de către interferon-γ. 27 3.2 Confirmarea knock-out-ului. 28 3.3 Fenotiparea bazală a șoarecelui șters Nlrc5. 29 3.3.1 Histologia bazală a organelor intestinale. 29 3.3.2 Valorile bazale de laborator. 32 3.4 Modele de provocare. 33 3.4.1 Șoc endotoxinic. 33 3.4.2 Stimulări prin LPS in vitro. 35 3.4.3 Colita indusă de dextran sulfat de sodiu (DSS). 36 4 Discuție. 42 4.1 Mouse-ul șters Nlrc5. 42 4.2 Exprimarea și inducerea Nlrc5 murin. 43 4.3 Ștergerea Nlrc5 protejează în modelul de inflamație acută. 44 4.4 Inflamarea agravată a șoarecelui șters Nlrc5 în colita indusă de DSS. 47 4.5 Efectul dicotomic al Nlrc5 în diferite modele de inflamație. 49 4.6 Outlook. 53 5 Rezumat. 55 Bibliografie. 56 Anexă Materiale utilizate. 61 Mulțumiri. 63 CV. 64

iv RIG RLR RNA Rpm RPMI-1640 RT-PCR sirna SD SEM Tab.TAE Taq TH TLR TMB TNF Tube Well WT Acid retinoic inducibil genă Acid retinoic inductibil gen (RIG) ca receptor Acid ribonucleic Runde pe minut Roswell Park Memorial Institute, mediu de cultură celulară specific Reacție în lanț transcriptază inversă-polimerază Acid ribonucleic cu interferență mică Deviație standard Eroare medie a tabelului Tris-Acetat-EDTA Termophilus aquaticus Celula T-helper Receptor asemănător Tetrametilbenzidinei Factor de necroză tumorală Vas de reacție plastic Bine într-o placă de reacție Șoareci sau șoareci de tip sălbatic Termeni englezi în cursiv în această lucrare. Pentru o diferențiere mai precisă, genele sunt scrise și cu caractere italice, spre deosebire de proteine, iar literele mici sunt utilizate pentru componentele murine și literele mari pentru ființele umane. În această lucrare, se folosește în cea mai mare parte actuala nomenclatură a comitetului pentru nomenclatura genetică a organizației genomului uman din 2008. Excepția este termenul de receptor Nod-like, care este utilizat pentru domeniul care leagă nucleotidele și pentru familia care conține repetări bogate în leucină datorită popularității sale.

Introducere 12 a fost efectuat un test de șoc endotoxinic în care interleukina-1 joacă un rol major. Pe de altă parte, a fost utilizat modelul complex al colitei experimentale, care include atât o fază acută cu mecanisme de vindecare a rănilor, cât și o fază cronică cu stimularea răspunsului imun adaptiv. Următoarele întrebări au fost investigate în această teză: Poate fi modificată o reacție inflamatorie acută sau cronică in vivo prin deficiența genetică pentru Nlrc5? Cum afectează ștergerea Nlrc5 răspunsul citokinelor în răspunsul inflamator acut și cronic? Cum afectează asemănarea structurală a Nlrc5, cu ceilalți receptori asemănători nodului, cunoscuți pentru asocierea lor cu anumite boli, rolul său în sistemul imunitar înnăscut?

Material și metode 25 secunde 70%, 80% și 90% izopropanol, apoi 2 x 5 minute 100% izopropanol). Acesta a fost urmat de 3 minute de hilenă ca solvent organic și acoperire în eukitt cu un slip de acoperire. 2.7 Statistici Datele au fost evaluate utilizând programul GraphPad Prism, GraphPas Software, La Jolla, SUA. Acest program a fost apoi folosit pentru a crea graficele.

Rezultate 30 de modificări examinate. Insulele Langerhans s-au prezentat însă neschimbate.Dacă nivelurile de creatinină ale șoarecilor eliminați cu Nlrc5 au fost reduse, rinichii au fost, de asemenea, examinați mai atent, glomerulii și tubulii fiind nemodificați. În general, șoarecii șterse Nlrc5 au prezentat histologic fără modificări relevante în raport cu grupul de comparație al șoarecilor de tip sălbatic.

Rezultate 31 splină Nlrc5 -/- șoarece șoarece sălbatic (C57BL/6) plămâni colon ganglioni limfatici rinichi pancreas Fig. 7: Histologia bazală a șoarecelui șters Nlrc5 și a șoarecelui de tip sălbatic colorarea HE nu a prezentat diferențe relevante.

Rezultatele 40 contează. După procesarea cdna, expresia citokinelor selectate a fost măsurată utilizând PCR în timp real. Cu 0,0024 unități relative, expresia interleukinei-1β a crescut de 1,7 ori la șoarecii șterse Nlrc5 (șoareci de tip sălbatic: 0,0014). Expresia interleukinei-18 (1,8 ori), KC (1,4 ori) și interferon-y (1,7 ori) a fost de asemenea găsită în colonul șoarecilor șterse Nlrc5 comparativ cu colonul șoarecilor de tip sălbatic. Șoarecii au crescut după 30 de zile de colită DSS. În schimb, TNF-a a fost reglat în jos. Conținutul de ADNc de 0,0006 la șoarecii șterse Nlrc5 sa dovedit a fi de 0,6 ori mai mic decât la șoarecii de tip sălbatic (0,0011) (Figura 15). Interleukina-12 a prezentat o expresie stabilă.