Stabilirea și analiza modelelor de mouse knock-out ale subunităților σ1 ale complexului AP-1 - PDF

Stabilirea și analiza modelelor de șoarece knock-out ale subunităților σ1 ale disertării complexului AP-1 pentru obținerea titlului de doctor al facultăților de științe matematice și naturale ale Georg-August-Universität din Göttingen prezentate de Jennifer Baltes de la Saarbrücken Göttingen 2008

D7 Vorbitor: Prof. Dr. K. von Figura Institutul de Biochimie II, Centrul de Biochimie și Biologie Celulară Moleculară de la Universitatea Georg-August din Göttingen Co-lector: Prof. Dr. Institutul R. Ficner pentru Microbiologie și Genetică de la Universitatea Georg-August din Göttingen Ziua examinării orale: 22 ianuarie 2008

Cuprins I Cuprins 1. Introducere. 1 1.1 Transport vezicular. 1 1.1.1 Clathrin. 4 1.1.2.1 Formarea veziculelor mediate de AP-1. 11 1.1.2.2 Motive de recunoaștere a complexului proteic adaptor. 13 1.1.2.3 Interacțiuni ale AP-1 cu proteine accesorii. 16 1.1.3 Adaptoare GGA. 19 1.1.4 Transport mediat de AP-1. 22 1.2 Modele knock-out de mouse ale AP-1 Adaptine. 25 1.2.1 Fenotipul șoarecilor γ-knock-out. 25 1.2.2 Fenotipul șoarecilor knock-out µ1. 26 1.2.3 Fenotipul șoarecilor knock-out σ1b. 26 2. Întrebare. 28 3. Material și metode. 29 3.1 Soluții și dispozitive utilizate frecvent. 29 3.1.1 Tampoane. 29 3.1.2 Medii de cultură. 29 3.1.3 Dispozitive. 30 3.1.4 Centrifuge și rotoare. 30 3.2 Metode biologice moleculare. 31 3.2.1 Izolarea ADN-ului genomic din biopsiile cozii. 31 3.2.2 Precipitarea ADN-ului de către etanol. 31 3.2.3 Extracția ADN-ului cu fenol-cloroform. 32 3.2.4 Izolarea ARN-ului din țesuturi. 32 3.2.5 Cuantificarea acizilor nucleici. 33 3.2.6 PCR. 33 3.2.6.1 Abordarea PCR pentru genotiparea șoarecilor σ1b -/- -. 35 3.2.6.2 PCR pentru genotiparea șoarecilor σ1a Gene Trap. 36 3.2.7 Restricția digestiei ADN-ului. 38 3.2.8 Separarea ADN-ului prin electroforeză pe gel pe geluri de agaroză. 38 3.2.9 Extragerea ADN-ului din gelurile de agaroză. 40 3.2.10 Ligarea fragmentelor de ADN. 41

Cuprins III 3.5 Metode biochimice ale proteinelor. 58 3.5.1 Extracția proteinei din celule întregi din celule. 58 3.5.2 Producerea omogenatului tisular. 58 3.5.3 Determinarea proteinelor conform Bradford. 59 3.5.4 Electroforeză pe gel de poliacrilamidă (SDS-Page) conform Laemmli. 59 3.5.5 Transferul proteinelor în nitroceluloză (Western blot). 62 3.5.5.1 Blot semi-uscat. 63 3.5.5.2 Blot umed. 63 3.5.5.3 Imunocolorarea pe membranele nitrocelulozice/PVDF. 64 3.6 alte metode. 66 3.6.1 ELISA pentru măsurarea concentrațiilor serice ale diferitelor adipokine. 66 3.6.2 Analiza FACS (sortare celulară activată prin fluorescență) a adipocitelor izolate. 67 3.6.3 Colorarea adipocitelor cu ulei roșu O. 67 4. Rezultate. 69 4.1 Fenotiparea tulpinii de șoarece cu deficit de σ1b. 69 4.1.1 Bilanțul de apă al șoarecilor cu deficit de σ1b. 69 4.1.2 Analiza serică a șoarecilor cu deficit de σ1b. 78 4.1.3 Funcția dependentă de σ1b a țesutului adipos. 79 4.1.3.1 Caracterizarea țesutului adipos. 80 4.1.3.2 Examinarea funcțională a țesutului adipos. 83 4.1.3.2.1 Toleranță la glucoză a șoarecilor cu deficit de σ1b. 83 4.1.3.2.2 Concentrațiile adipocitokinelor în ser. 85 4.1.2.3.2 Influența unei diete bogate în grăsimi asupra greutății șoarecilor cu deficit de σ1b. 87 4.1.3.3 Diferențierea țesutului adipos. 90 4.1.4 Studii comportamentale pe șoareci cu deficit de σ1b. 100

Abrevieri V Abrevieri Å Ångström Fig. Figura ad umplere până la volumul final a.d. aqua destillata ADP adenozin difosfat AP adaptor proteic complex APS amoniu persulfat ARF ADP-factor de ribozilare BFA Brefeldin A bp pereche de baze BSA bovine ser albumină C grade Celsius CCV vesiculă acoperită cu clatină cdna ADN complementar Ci Curie (2,22x10 6 număr pe minut) COP Deoxiadenozin trifosfat dctp deoxicitidin trifosfat DEPC dietilpirocarbonat dgtp deoxiguanozin trifosfat dh adică DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium dntp deoxiribonucleotidă DMSO dimetil sulfoxid ADN acid dezoxiribonucleic DTT ditiotreitol dttp deoxitimidin trifosfat E. coli Escherichia coli EDTA etilen diamină tetraacetat

Abrevieri VI EGF factor de creștere epitelial Test ELISA enzimatic legat de imuno-sorbent En Eniled ENTH epsin N-terminal homology ER Reticul endoplasmatic ERGIC ER-Golgi compartiment intermediar ES celule stem embrionare și colab. et alii (lat.: și altele) EtBr bromură de etidiu FACS triere celulară activată prin fluorescență FKS vițel fetal ser g grame GAE γ-adaptină-ureche omologă GAP Proteine activatoare GTPază GAPDH gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază GGA și TOM1 PIB guanozină trifosfat Factor de schimb PIB-nucleotide GGA proteine care leagă ARF localizate Golgi, conținând γ-urechi GLUT4 transportor de glucoză 4 GTP guanozină trifosfat h oră H 2 O apă adică 2 O apă distilată HRP hrean peroxidază IgG imunoglobulinăG ip intraperitoneal k kilo kb kilobases ko knock out L litru LB bulion de lizogenie M molar

Abrevieri VII ma miliampere MEF șoarece fibroblaste embrionare mg miligrame min minut ml mililitri mm milimetri mm milimolari mmhg milimetri mercur MOPS Acid 3- (N-morfolin) -propanesulfonic MPR manoză-6-fosfat receptor mrna mesager nm acid ribonucleic µg nanometri microlitri nanograme µg nanometri nanolitri nanograme µg nanometri nanometri µg nanometri nanometri nanograme µg nanometri nanolitri nanograme µg nanometri nanometri µg nanometri nanometri µg nanometri micrograme nanometri nanograme µg nanometri micrograme nanometri nanograme µg nanometri nanometri µg nanometri nanometri µg nanometri micrograme nanometri nanograme µg nanometri micrograme nanometri nanograme µg nanometri micrograme nanometri ng n-terminal aminoterminal OD densitate optică PAA poliacrilamidă PBS fosfat tamponat salină PCR polimerază reacție în lanț logaritm decadic negativ al concentrației de protoni PI-3-P fosfatidilinozitol-3-fosfat PI-4-P fosfatidilinozitol-4-fosfat PI-4,5P 2 fosfatidilinolizol, 5-bisfosfat PM membrană plasmatică pm picomolar PP2A proteină fosfatază 2A PVDF poliviniliden difluorură ARN acid ribonucleic ARNse ribonuclează RT temperatura camerei rpm rotunde pe minut s. vezi SDS sulfat de sodiu dodecil

Abrevieri VIII SNARE SSC sec Tab. Taq TE TEMED TGN Tris U ü.n. UV V cf. VHS WT w/v v/v xg de ex. "Receptori de atașare SNAP și NSF" al doilea tabel citrat salin Thermophillus aquaticus Tris/HCl EDTA N, N, N, N tetramethyldiamine trans-Golgi rețea trishidroximetilaminometan enzimă unitate (unitate) volți de lumină ultravioletă peste noapte compară greutatea tipului sălbatic Vps27p, Hrs și STAM Raportul volum-volum de x ori mai mare decât accelerația datorată gravitației, de exemplu

Introducerea 7 este colocalizată (Simpson și colab., 1997; Peden și colab., 2004). Până în prezent, nu s-a găsit AP-3 în CCV purificate din țesutul cerebral (Simpson și colab., 1996; Dell'Angelica și colab., 1997b; Blondeau și colab., 2004). Studiile funcționale cu motivul mutant de legare a clatrinei AP-3 nu au arătat nici o interacțiune. Cu toate acestea, populația asociată cu clathrin, precum și fără clathrin, pare să existe în celulă (Peden și colab., 2004). CCV-urile legate de AP-3 ar putea fi izolate de linia de celule tumorale epiteliale umane HeLa (Borner și colab., 2007). Prin urmare, s-ar putea ca legarea clatrinei-AP-3 să fie foarte fragilă sau cantitatea de vezicule învelite în clatină care leagă AP-3, variază în diferite tipuri de celule (Newell-Litwa și colab., 2007). Complexul AP-4 nu are o cutie clasică de clatrin și nu a fost detectată nicio interacțiune specifică. Cu toate acestea, AP-4 a fost detectat în vecinătatea clatrinei în imaginile microscopului electronic (Barois și Bakke, 2005). Figura 3: Căi de transport specifice mediate de proteinele adaptoare TGN: rețeaua Trans-Golgi; b ee: endozom timpuriu basolateral; a ee: endozom timpuriu apical; Lys: Lysosom, re: reciclarea Endosomului pentru explicații suplimentare vezi textul (după Schu, 2005).

Introducerea 9 are un situs de legare, dar subunitatea µ1, spre deosebire de µ2, nu are un motiv de legare la fosfatidilinozitol fosfat. Figura 4: Structura și compoziția (a) AP-1 și (b) AP-2 Subunitățile individuale sunt identificate prin culorile corespunzătoare așa cum se arată în schemele (b) și (d). Site-ul de legare YxxΘ respectiv este evidențiat de un oval și site-ul de legare PI-4-P în AP-1 și site-ul de legare PI-4,5-P2 ocupat de D-mioo-inozitol-hexakisfosfat (IP6) în AP2 de un cerc. Comparativ cu subunitatea µ2, subunității µ1 a AP-1 îi lipsește site-ul de legare la fosfatidilinozitol. (Collins și colab., 2002; Heldwein și colab., 2004) Miezul complexelor adaptorului măsoară aproximativ 100 Å x 80 Å, cu domeniul balamalei celor două subunități mari extinzându-se probabil până la 200-300 Å ca și nu are o structură secundară stabilă. Prin urmare, domeniile urechii pot fi localizate departe de nucleul legat de membrană al complexului și pot interacționa cu alte proteine din citoplasmă.

Introducere 10 Figura 5: Reprezentarea schematică a diferitelor izoforme ale subunităților AP-1. Două izoforme sunt cunoscute atât pentru γ, cât și pentru µ1. Există chiar și trei izoforme descrise pentru σ. σ1b a fost detectat în trei variante de îmbinare. Pentru multe dintre adaptine, izoformele au fost descrise la mamifere care sunt codificate de mai multe gene. Variantele de îmbinare au fost găsite numai pentru α-adaptină. În cazul AP-1, cel puțin o izoformă alternativă este exprimată pentru toate proteinele implicate, cu excepția subunității β1. O compilație schematică a acestor proteine este prezentată în Figura 5. Izoforma γ2 este omologă cu 60% adaptina γ1. Este scurtat în regiunea variabilă a balamalei. Spre deosebire de subunitatea γ1, nicio interacțiune între γ2 și subunitatea β nu poate fi detectată în sistemul hibrid de drojdie. Acest lucru sugerează că nu există un complex in vivo cu γ2. Trei gene sunt cunoscute pentru σ1-adaptină, σ1a, -B și -C. Acestea prezintă o identitate de 70-80% la nivelul proteinelor (Riel, 2004). In vitro, σ1a și σ1b se leagă la ambele izoforme γ (Takatsu și colab., 1998; Takatsu și colab., 2001). În plus, au fost realizate trei variante diferite de îmbinare în laboratorul nostru

Introducere 15 În general, mai multe reziduuri de aminoacizi acizi le preced, acestea fiind numite și motive acide de dileucină în grup. În acest caz, aspartatul (D) nu poate fi înlocuit. Spre deosebire de semnalele (D, E) xxxL (L, I), DxxLL nu se leagă de complexele AP in vitro, ci de adaptoarele monomerice din familia GGA (Puertollano și colab., 2001; Zhu și colab., 2001 ) (vezi 1.1.3). O altă familie de motive de sortare constă dintr-o secvență de aminoacizi care conțin unul până la trei situri de fosforilare pentru cazeina kinază II (CKII). Acest motiv se găsește în multe proteine transmembranare care circulă între TGN și endozomi. Fosforilarea prin CK-II este necesară în principal pentru transportul de întoarcere de la endozomi la TGN. Pentru proteina PACS1 (proteina de sortare a clusterului acid fosfofurinic 1) s-ar putea arăta că leagă atât grupările acide fosforilate, cât și AP-1 și AP-3. Suprafața de legare pe AP-1 a fost identificată pe µ și σ (Wan și colab., 1998; Crump și colab., 2001).

Introducere 16 1.1.2.3 Interacțiunile AP-1 cu proteinele accesorii Figura 6: Rețeaua AP-1 și partenerii săi de interacțiune Liniile de legătură dintre proteinele individuale simbolizează o interacțiune. Au fost descriși parteneri de interacțiune suplimentari despre care se crede că generează un mediu specific CCV-urilor AP-1. Majoritatea acestor proteine accesorii se leagă de domeniile urechii marilor subunități ale AP-1, cu interacțiuni γ1 având cea mai mare afinitate. Deoarece aceste domenii prezintă cea mai mică similitudine între adaptine, se fac conexiuni foarte specifice. Figura 6 prezintă proteinele de legare AP-1 și interacțiunile dintre componente sunt simbolizate prin linii. Nu toate aceste proteine pot fi discutate în detaliu mai jos, așa că mă voi limita la cele pentru care sunt disponibile cele mai multe informații. Funcțiile majorității acestor proteine sunt necunoscute și importanța legării la AP-1 a fost investigată doar pentru câteva. Ultimul grup include ARF1GAP, care este necesar pentru dizolvarea învelișului proteic. De asemenea, puteți utiliza Rabaptin5

Introducere Sunt cauzate 19 reziduuri în aval de motivele identificate, WVQF și WGDF, ale acestor proteine asociate (Mattera și colab., 2004). 1.1.3 Adaptatori GGA Proteinele GGA monomerice (proteine care leagă ARF, localizate Golgi, conținând γ-urechi) contribuie la formarea proteinelor acoperite cu clatrin pe TGN. Proteinele GGA au fost identificate în baze de date pe baza omologiei unuia dintre domeniile lor la domeniul urechii γ-adaptinei și examinate în ceea ce privește rolul lor în procesele de sortare la TGN (Bonifacino, 2004). Se găsesc și pe endozomi. Trei gene care codifică GGA1, GGA2 și GGA3 au fost descrise la mamifere. Familia este conservată în eucariote, iar drojdia are și două proteine GGA. Proteinele GGA au o structură modulară (vezi Figura 7). Cele trei domenii ale sale pliate sunt legate de secvențe nestructurate. Figura 7: Modelul structurii GGA1 Structurile domeniilor individuale au fost combinate aici pentru a forma un model și partenerii lor de legare au fost atribuiți domeniilor individuale. Modificat din (Ghosh și Kornfeld, 2004)