Ștergerea Tbc1d1 suprimă obezitatea la șoarecii cu deficit de leptină - Jurnal internațional
subiecte
abstract
Fundal:
Variante ale genei TBC1D1 au fost implicate în trăsături legate de obezitate la mai multe specii, inclusiv la oameni, șoareci, iepuri și pui. În timp ce variantele TBC1D1 au fost legate de obezitate la om, întreruperea genei Tbc1d1 a redus greutatea corporală la șoareci. TBC1D1 a fost identificat ca un regulator al transportului glucozei insulino-dependent în mușchii scheletici, dar rolul său în homeostazia energetică în starea obeză rămâne neclar. A fost investigată influența unei deficiențe de TBC1D1 asupra homeostaziei energetice, a glucozei și a metabolismului lipidic într-un model de șoarece stabilit pentru obezitate.
Metode:
Leptina obeză (ob/ob) și șoarecii Tbc1d1 dublu deficienți (D1KO-ob/ob) au fost generați prin încrucișarea B6 supraponderală. V. Șoareci Lep ob/ob cu șoareci slabi cu deficit de Tbc1d1 pe un fundal C57BL/6J. Șoarecii masculi care au primit fie o dietă standard (SD), fie o dietă bogată în grăsimi (HFD) au fost evaluați pentru greutatea corporală, compoziția corporală, aportul alimentar, activitatea fizică voluntară și cheltuielile de energie prin calorimetrie indirectă. Au fost analizate toleranța la glucoză și insulină, precum și transportul glucozei și oxidarea acizilor grași în mușchii scheletici.
Rezultate:
La șoarecii obezi, deficiența de Tbc1d1 a dus la o reducere a greutății SD și HFD. Cu toate acestea, aportul de alimente a rămas neschimbat în SD sau chiar a crescut la șoarecii cu deficit de Tbc1d1 alimentați cu HFD, fără nicio modificare a activității fizice voluntare. În ciuda transportului de glucoză stimulat de insulină semnificativ redus și a oxidării crescute a acizilor grași la mușchiul schelet izolat intact, șoarecii obezi cu deficit de Tbc1d1 nu au prezentat modificări semnificative ale glicemiei și toleranței la glucoză comparativ cu martorii obezi. Calorimetria indirectă a arătat că șoarecii cu deficit de Tbc1d1 obezi au avut un coeficient respirator redus împreună cu o cheltuială energetică zilnică crescută.
Concluzii:
La șoarecii cu deficiență de leptină obeză, deficitul de TBC1D1 nu are niciun efect asupra comportamentului hrănirii sau aportului de energie, dar duce la creșterea cheltuielilor de energie, modificarea preferinței substratului energetic, cu o oxidare crescută a acizilor grași și suprimarea obezității. TBC1D1 poate juca un rol conservat evolutiv în reglarea homeostaziei energetice la vertebrate.
introducere
materiale si metode
materiale
Insulina recombinantă umană (Actrapid HM Penfill) a fost achiziționată de la Novo Nordisk Pharma GmbH, Mainz, Germania și AICAR (Aminoimidazol Carboxamidă Ribonucleotidă) a fost achiziționată de la Enzo Life Sciences, Loerrach, Germania. Radiochimicele au fost obținute de la Hartmann Analytic, Braunschweig, Germania ([1-14 C] -D-Manitol, 0,1 mCi ml -1) și de la American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO, SUA ([9, 10 (n)) - 3 H] acid palmitic, 1 mCi ml −1; 2- [1, 2-3 H (N)] deoxi-D-glucoză, 1 mCi ml −1).
Generarea de animale cu deficit de Tbc1d1 obez
Genotipare
ADN-ul genomic din vârfurile cozii șoarecilor a fost izolat folosind InViSorb Genomic DNA Kit II (Invitek, Berlin, Germania). Șoarecii au fost genotipați pentru Tbc1d1 (D1KO-Fwd: 5'-CAA-CAT-TCT-GAA-GGC-CTT-CTG-3 ', D1KO-Rev: 5'-TCC-CTG-ACA-AGC-TGA-GT- 3 '; WT-Fwd: 5'-GGA CAA GCA GCTT TCT TGT TT-3', WT-Rev: 5'-TCC TGG TCC AGA AGC GAG-3 ') și pentru paralelele ob (Fwd: 5'- TGT CCA AGA TGG ACC AGA CTC-3 '), Rev: 5'-ACT-GGT-CTG-AGG-CAG-GGA-GCA-3').
Extracția ARN și sinteza ADNc
ARN-ul a fost extras din diferite țesuturi de șoarece folosind QIAzol și RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) în conformitate cu liniile directoare ale producătorului. ADNc a fost transcris din 2 ug de ARN total folosind GoScript Reverse Transcriptase (Promega, Mannheim, Germania) și hexameri aleatori P (dN) 6 (Roche, Mannheim, Germania).
PCR cantitativă în timp real
PCR cantitativă în timp real a fost efectuată folosind sonde TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) pentru Tbc1d1 (Mm00497989_m1), PrlR (Mm00599957_m1) și pentru Actb (FAM-TTG AGA CCT TCA ACA CCC CAG CCA-TAMRA) . MWG, Ebersberg) ca genă de menaj. Analizele au fost efectuate cu sistemul PCR rapid în timp real 7500 de la Applied Biosystems (Applied Biosystems). Datele au fost normalizate în conformitate cu metoda ΔCt prin scăderea valorii Ct a beta-actinei din valoarea Ct a genei țintă. 16
Analiza greutății corporale, a compoziției corporale și a lungimii corpului
Greutatea corporală totală a fost analizată cu o balanță electronică (Sartorius, Göttingen, Germania). Compoziția corpului (grăsime corporală și masă slabă) a fost determinată cu un spectrometru de rezonanță magnetică nucleară (analizor RMN Bruker-Minispec mq10, Bruker Optics, Ettlingen, Germania). Lungimea corpului a fost analizată prin măsurarea lungimii de la nas la anus.
Testele de toleranță la glucoză, insulină
După post peste noapte, animalele au primit un bolus de glucoză oral (2 g per kg greutate corporală, soluție 20%) printr-o sondă. Probele de sânge au fost extrase din vârful cozii la diferite momente (0, 15, 30, 60 și 120 de minute), iar nivelurile de glucoză și insulină au fost determinate așa cum este descris mai jos. Pentru testul de toleranță la insulină, șoarecii au fost postiti peste noapte și 2 UI de insulină pe kg de greutate corporală au fost injectați intraperitoneal. Glicemia a fost determinată la 0, 15, 30 și 60 de minute după injecție.
Parametrii sângelui
Glicemia a fost determinată cu un glucometru (Contour, Bayer, Leverkusen, Germania). Insulina plasmatică a fost măsurată cu un ELISA (Insulin Mouse Ultrasensitive ELISA, Alpco, Salem, MA, SUA), corpuri cetonice plasmatice cu kitul auto Corpuri cetonice totale, grăsimi libere, acizi cu sistemul NEFA-HR 2 (ambele Wako Chemicals, Neuss, Germania ). Adiponectina a fost analizată cu kitul ELISA pentru șoarece Adiponectină (Millipore, Billerica, MA, SUA), adipocitokinele IL-6, MCP-1, PAI-1 și Rezistina au fost analizate cu kitul Milliplex MAP, Adipokina serică de șoarece (Millipore) și IGF -1 cu sistemul de dezvoltare DuoSet ELISA (R & D Systems, Abington, Marea Britanie). Trigliceridele și glicerina liberă au fost determinate cu setul de determinare a trigliceridelor serice (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania). Toți parametrii de plasmă au fost determinați conform descrierii producătorului.
Analiza absorbției glucozei și a oxidării acizilor grași în mușchii scheletici izolați
Șoarecii au fost anesteziați și mușchii extensorului digitorum lung și solei de la picioarele din spate au fost disecați cu atenție. Mediul de incubație constă din tampon bicarbonat Krebs-Henseleit suplimentat cu 5 mM HEPES și 0,1% albumină serică albină fără acid gras. Incubația a fost efectuată într-o baie de apă (30 ° C) cu gazare continuă (95% O 2/5% CO 2) și agitare ușoară. Pentru a determina absorbția glucozei, mușchii extensorului digitorului lung au fost incubați timp de 30 de minute cu 5 mM glucoză și 15 mM manitol în absența sau prezența insulinei 120 nM. După o incubare finală cu 1 mM [3 H] 2-deoxi-glucoză (2,5 mCi ml -1) și 19 mM [14 C] manitol (0,7 mCi ml -1) timp de 20 de minute, mușchii au fost imediat în azot lichid și gheață depozitate congelate la -80 ° C. Pentru a determina rata de oxidare a acizilor grași, mușchii solei au fost incubați în tampon bicarbonat Krebs-Henseleit conținând 5 mM glucoză, 15 mM manitol, 3,5% albină serică albumină fără acid gras, 4 mCi ml -1 [ 3 H] palmitat și 600 μM conțineau palmitat nemarcat cu sau fără 2 mM AICAR la 30 ° C timp de 120 de minute și radioactivitatea a fost măsurată prin numărarea scintilației mediului.
Calorimetrie indirectă
Coeficientul respirator și analizele EE au fost descrise în altă parte. 7 Pe scurt, animalele au trecut printr-o fază de adaptare cu 24 de ore înainte de măsurare. Cuștile au fost plasate într-o cameră climatică la 22 ° C, iar consumul de oxigen (VO 2) și producția de dioxid de carbon (VCO 2) au fost monitorizate timp de 23 de ore la un debit de
Hrană-băutură
Aportul alimentar și activitatea fizică au fost monitorizate cu un sistem automatizat de analiză a EST (tip 302015-c/32, TSE Systems, Bad Homburg, Germania). Animalele au avut acces gratuit la hrană și senzorii de apă și greutate de pe coșurile de hrănire au înregistrat cantitatea de hrană consumată de fiecare animal. Activitatea fizică a fost determinată cu senzori în infraroșu.
Analiza Western blot
Trigliceride hepatice
Țesutul hepatic a fost omogenizat în tampon fosfat de sodiu 10 mM cu 1% polioxietilen-10-trideciletan și 1 mM EDTA folosind un liser tisular (Qiagen). Omogenatul a fost incubat timp de 5 minute la 70 ° C și centrifugat timp de 10 minute la 16.000 rcf. Trigliceridele hepatice au fost măsurate în supernatant folosind kitul (TRIGS) (Randox, Crumlin, Marea Britanie) așa cum este descris în manual.
Glicogen tisular
Țesuturile au fost omogenizate în KOH 1 M, incubate timp de 30 min la 70 ° C și neutralizate cu acid acetic concentrat. S-a adăugat amiloglucozidază (Sigma-Aldrich) și probele au fost incubate peste noapte la 37 ° C. După centrifugare (10 min, 2000 rcf), glucoza din supernatant a fost măsurată cu Glucoza Liquicolor (Uman, Taunusstein, Germania) în conformitate cu liniile directoare ale producătorului.
Rezultate
Ștergerea Tbc1d1 duce la o reducere semnificativă a greutății corporale la șoarecii obezi
Greutatea corporală și compoziția corporală a șoarecilor WT și D1KO ob/ob. ( A ) Greutate corporala, ( ) Masa totală de grăsime corporală și ( c ) Masa corporală slabă a șoarecilor masculi WT și D1KO-ob/ob crescuți fie pe SD, fie pe HFD. Datele reprezintă mijloace ± sem; n = 17-30 (SD) și n = 6-23 (HFD); * P -1 la 24 ore ± 0,054 kJ g -1 la zi) 24 ore; D1KO-ob/ob: 1,44 kJ g -1 la 24 ore ± 0,09 kJ g -1 la 24 ore). La hrănirea unui HFD, cantitatea de alimente consumate a crescut semnificativ la șoarecii mai slabi D1KO-ob/ob comparativ cu animalele WT-ob/ob (WT-ob/ob: 1,32 kJ g -1 la 24 h ± 0 054 kJ) g -1 la 24 ore; D1KO-ob/ob: 1,63 kJ g -1 la 24 ore ± 0,087 kJ g -1 la 24 ore; P = 0, 00015). În plus, analiza aportului alimentar la șoareci mai tineri de 7 săptămâni a arătat rezultate similare, fără diferențe semnificative la animalele hrănite cu SD și consum crescut de alimente la șoarecii D1KO-ob/ob cu deficit de Tbc1d1 cu deficit de HFD (Figura suplimentară 2d). .
Aportul alimentar și activitatea fizică a șoarecilor WT și D1KO ob/ob. ( A ) Distribuția țesuturilor TBC1D1 la șoareci masculi de 16 săptămâni WT-ob/ob, analizați prin Western blot. ( ) Exprimarea Tbc1d1 în diferite regiuni cerebrale ale șoarecilor obezi WT și D1KO-ob/ob, precum și la șoarecii slabi WT-ob/+ și în mușchii scheletici (M. quadriceps) de șoareci WT și D1KO-ob/ob care au fost efectuați de au fost analizate PCR cantitative în timp real cu beta-actină ca genă de menaj. Expresia Tbc1d1 a fost normalizată la expresia șoarecilor WT în mușchiul scheletic. Șoarecii aveau vârsta de 16 săptămâni și hrăneau un SD; Datele reprezintă mijloace ± sem; n = 6-10. ( c ) Aportul de furaje măsurat pe parcursul a 24 de ore, ajustat la greutatea corporală totală și ( d Activitate fizică voluntară analizată prin infraroșu la șoareci masculi în vârstă de 15 săptămâni crescuți fie cu SD, fie cu HFD. Datele reprezintă mijloace ± sem; n = 5-11; * P -1 ± 0,032 kJ g -1; D1KO- ob/ob: 2,78 kJ g -1 -1 0,032 kJ g -1; P = 0,009) (Figurile 3c - d).
Controlul glicemic al șoarecilor WT și D1KO-ob/ob. ( A ) Glicemia din șoareci masculi în vârstă de 17 săptămâni în stare postprandială pe SD sau HFD. ( ) Glicemia din șoareci masculi de 12 săptămâni hrăniți cu SD și ( c ) nivelurile corespunzătoare de insulină plasmatică în timpul unui GTT oral cu 2 g glucoză pe kg. ( d ) Glicemia din șoareci masculi de 14 săptămâni crescuți pe SD în timpul unui test de toleranță la insulină intraperitoneală cu 2 UI de insulină pe kg. Datele reprezintă mijloace ± sem; n = 5-9; * P 3 H] 2-deoxi-glucoză în mușchiul scheletic analizat așa cum este descris. Așa cum se arată în FIG. 5a, ambele grupuri cu deficit de leptină au prezentat o absorbție redusă de glucoză sub stimularea insulinei comparativ cu animalele de control slab WT-ob/+ (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg -1 la 20 minute ± 0,40 nmol mg -1 pe zi) 20 min; WT-ob/+: 6,09 nmol mg -1 la 20 min ± 0,039 nmol mg -1 la 20 min; P = 0,079). Cu toate acestea, șoarecii D1KO-ob/ob au prezentat o absorbție redusă semnificativ a glucozei stimulată de insulină comparativ cu șoarecii WT-ob/ob (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg -1 la 20 min ± 0,40 nmol mg -1 la 20 min; D1KO-ob/ob: 3,26 nmol mg –1 pe 20 min ± 0,19 nmol mg –1 pe 20 min; P = 0,0019).
Influența creșterii oxidării acizilor grași asupra dezvoltării greutății corporale este totuși controversată. În două studii independente cu șoareci Acc2 -/- s-a sugerat că un aflux mai mare de acizi grași în mitocondrii este suficient pentru a crește EE și a scădea greutatea corporală. 21, 22 Într-unul dintre aceste studii, șoarecii Acc2 -/- s-au dovedit a avea niveluri scăzute de malonil-CoA și, prin urmare, au crescut β-oxidarea în mușchiul scheletic. 21 În cel de-al doilea studiu, autorii au observat o creștere a EE și o scădere a greutății corporale la șoarecii Acc2 -/- și au ajuns la concluzia că aceste efecte pot fi atribuite direct unei cantități crescute de acizi grași și o creștere ulterioară a oxidării în mitocondrii. . 22 În schimb, un studiu recent efectuat cu șoareci Acc2 -/- de Hoehn și colegii 23 nu a reușit să prezinte modificări ale EE sau ale greutății corporale, sugerând că β-oxidarea crescută poate să nu fie suficientă pentru a explica efectul de suprimare a obezității. Șoareci cu deficit de Leptină și Tbc1d1.
Obezitatea se corelează cu sensibilitatea scăzută la insulină și, dimpotrivă, se poate aștepta ca o scădere a grăsimii corporale să ducă la o creștere a sensibilității la insulină. 24 Deși șoarecii D1KO-ob/ob cu deficit de Tbc1d1 cu un conținut total mai scăzut de grăsime corporală decât martorii au fost semnificativ mai slabi, nivelul zahărului din sânge nu a fost redus. În plus, nici toleranța la glucoză, nici sensibilitatea la insulină nu au fost modificate semnificativ la acești șoareci, indicând faptul că eliberarea scăzută de glucoză în mușchiul scheletic al șoarecilor D1KO-ob/ob cu deficit de Tbc1d1 a compensat efectul benefic al suprimării obezității asupra glicemiei la acești șoareci. poate sa.
Mutațiile din TBC1D1 au fost, de asemenea, legate de controlul greutății corporale la om. Două studii au arătat o legătură între varianta de codare R125W și indicele de masă corporală (IMC) la femeile susceptibile la obezitate, în timp ce polimorfismele cu un singur nucleotid TBC1D1 la bărbații și femeile din EPIC Potsdam au găsit o asociere puternică cu IMC și circumferința taliei. a devenit cohorta. 10, 11, 25 Studiile corespunzătoare pe animale la porci, iepuri și pui au relevat o legătură între variantele TBC1D1 și compoziția corpului și obezitatea. 12, 13, 14, 15 Studiul nostru actual la șoareci obezi sugerează că TBC1D1 joacă un rol conservat evolutiv în reglarea greutății corporale și a compoziției vertebratelor. Baza moleculară a acestei observații și posibila selecție evolutivă a variantelor TBC1D1 necesită investigații suplimentare.