Studiul efectelor pe termen scurt ale consumului crescut de alcool și țigări asupra

subiecte

abstract

introducere

Infertilitatea afectează în jur de 15% din cuplurile care încearcă să conceapă, iar în jumătate din aceste cazuri cauza este legată de problemele de reproducere masculine 1. Un procent mare din cazurile de infertilitate masculină sunt idiopatice (

În Portugalia, consumul de alcool a crescut în rândul persoanelor cu vârsta peste 15 ani (în medie 12,9 litri/persoană/an) 14, în timp ce aproximativ 32,4% din portughezii cu vârsta peste 15 ani au fumat. Există o puternică tradiție a abuzului acut de alcool, țigări și droguri în timpul sărbătorilor academice portugheze. Acest lucru oferă condiții excepționale pentru studiul acestei probleme, întrucât un număr mare de bărbați tineri se expun voluntar la niveluri ridicate de factori nocivi într-o perioadă de timp bine definită și limitată, care au avut un stil de viață relativ sănătos înainte și după expunere.

Scopul acestui studiu a fost de a examina efectele timpurii și târzii pe termen scurt ale modificărilor acute ale stilului de viață, în special consumul de alcool și țigări, asupra parametrilor de bază ai spermei umane și echilibrului oxidativ. Având în vedere importanța plasmei seminale pentru maturarea, nutriția și protecția spermei, a fost de asemenea evaluată funcția epididimului și a glandelor secundare.

Metode

Proiectarea studiului și participanții

Efectele mai multor factori de stil de viață asupra calității materialului seminal au fost examinate în eșantioane de la voluntari sănătoși bărbați tineri, în vârstă de reproducere, în trei momente definite cu precizie: înainte (punctul de timp 1 - TP1), o săptămână (punctul de timp 2 - TP2) și trei luni (punctul de timp 3 - TP3) după sărbătorile academice portugheze (un eveniment de 7 zile) în care abuzul de alcool, țigări și droguri sunt o tradiție (Fig. 1). Au fost luați în considerare doar voluntarii care au furnizat un eșantion în toate cele trei TP.

Confuzii neascuțiți întâlniți în timpul sărbătorilor academice includ factori precum dieta și modificările ritmului circadian. TP, puncte în timp.

Studiul a fost promovat în campusul Universității din Aveiro și doar studenții din acea universitate au fost acceptați ca voluntari. Reclama a precizat în mod clar ipoteza și principalele obiective ale studiului și nu a fost aplicată nicio compensație financiară. Toți participanții au primit instrucțiuni scrise clare cu privire la modul de prelevare a probelor și au răspuns la un chestionar de îndeplinire asistată de fiecare dată când a fost prelevat un eșantion. Chestionarele conțineau întrebări despre durata abstinenței, bolile anterioare/recente, consumul de droguri și alcool, consumul de țigări și droguri (cum ar fi canabisul și cocaina). Parametrul consumului de alcool a fost definit ca cantitatea totală estimată de alcool (în grame). În SP1 și SP3, acest parametru a luat în considerare consumul de alcool pe săptămână în luna dinaintea sărbătorilor academice. TP2 a reflectat consumul de alcool în timpul săptămânii academice a festivalului. Parametrul de consum de țigări a fost definit ca cantitatea totală estimată de nicotină (în miligrame). În SP1 și SP3, acest parametru a luat în considerare consumul săptămânal de nicotină în luna dinaintea sărbătorilor academice. TP2 a reflectat consumul de nicotină în timpul săptămânii festivalului academic. Toate datele au fost anonimizate.

Recunoașterea etică

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică și Revizuire Internă al Spitalului Infante D. Pedro EPE, Aveiro, Portugalia (numărul procesului: 36/AO) și realizat în conformitate cu standardele etice ale Declarației de la Helsinki. Toți participanții au primit instrucțiuni scrise clare cu privire la proiectarea studiului și au semnat o declarație de consimțământ care permite probelor să fie utilizate în scopuri științifice.

Eșantionarea materialului seminal, analiza de bază a materialului seminal și pregătirea spermei

Probele de material seminal au fost obținute prin masturbare într-un recipient steril și livrate în termen de 30 de minute pentru analiza de bază a materialului seminal. Toate probele au fost analizate de tehnicieni experimentați conform criteriilor Organizației Mondiale a Sănătății 15. Pe scurt, după ce probele de material seminal au fost complet lichefiate la 37 ° C timp de aproximativ 30 de minute, a fost efectuată o examinare macroscopică. Examenul microscopic a inclus analiza motilității, concentrației și morfologiei spermei. Toate analizele microscopice au fost efectuate folosind un microscop Zeiss Primo Star (Carl Zeiss AG, Germania). Probele de material seminal au fost spălate de trei ori în PBS. Plasma seminală a fost colectată de la prima spălare și utilizată pentru teste ulterioare. Extractele de spermă au fost resuspendate în 1% SDS. Concentrația de proteine a fost măsurată utilizând un test de acid bicinconic (Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, SUA) și absorbanța finală a fost măsurată la 562 nm într-un cititor de microplăci (seria Infinite® 200 PRO, Tecan Trading AG, Elveția).

Analiza Western blot a expresiei enzimelor antioxidante superoxid dismutaza 1 (SOD1) și glutation peroxidaza 4 (GPx4)

Extractele de spermatozoizi au fost sonicate, fierte și cantități egale de proteine (50 ug) au fost încărcate într-un gel SDS-PAGE 10% și transferate într-o membrană de nitroceluloză. Imunodetecția a fost efectuată folosind șoareci anti-SOD1, 1: 1000 (MABC864, Merck Milipore, Darmstadt, Germania) și iepure anti-GPx4 (ABC269, Merck Milipore, Darmstadt, Germania), urmată de incubare cu infraroșul adecvat -Anticorpi secundari (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, Marea Britanie). Beta-tubulina (Merck Milipore, Darmstadt, Germania) a fost utilizată ca control de încărcare. Membrana a fost scanată cu un sistem de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR Biosciences, Cambridge, Marea Britanie).

Determinarea grupării carbonil (CG) prin slot blot

Extractele de spermatozoizi care conțin 30 pg de proteine au fost derivatizate cu 2,4-dinitrofenilhidrazină 20 mM dizolvate în acid trifluoroacetic 10% și neutralizate cu 1,5 părți în volum de 2 M Tris cu 18% mercaptoetanol. Pentru realizarea blotului slot, proba a fost diluată la 0,002 μg/μl și introdusă într-o membrană de nitroceluloză în dispozitivul slot blot (BioRad Portugalia, Sintra, Portugalia). Membrana a fost incubată cu iepure anti-DNP, 1: 5000 (MAB2223, Merck KGaA, Darmstadt, Germania), urmată de un anticorp secundar infraroșu anti-iepure (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, REGATUL UNIT). Detecția a fost efectuată în sistemul de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR Biosciences, Cambridge, Marea Britanie).

Determinarea 3-nitrotirozinei (3-NT) în spermatozoizi prin pete slot

Extractele de spermatozoizi au fost în 1xTBS la o concentrație finală de 1? g/u Am diluat. Probele au fost aplicate într-un slot blot (BioRad Portugalia, Sintra, Portugalia) într-o membrană de nitroceluloză. Apoi, membrana a fost acoperită cu anti-nitrotirozină de iepure, 1: 1000 (DAM1514077, Merck KGaA, Darmstadt, Germania), urmată de un anticorp secundar infraroșu anti-iepure (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd, Cambridge, UK) incubate. Detectarea a fost efectuată în sistemul de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, Marea Britanie).

Starea generală a antioxidantului (TAS)

Concentrația de antioxidanți din celulele spermatozoizilor a fost măsurată folosind testul Total Antioxidant Status (TAS) (NX2332, Randox Laboratories, Crumlin, Irlanda de Nord). Protocolul furnizat de producător a fost modificat astfel încât să poată fi utilizată o microplacă (reactivii și cantitățile de probe au fost reduse).

Analiza biochimică a markerilor glandelor sexuale epididimale și accesorii

Markerii biochimici ai funcției epididimului (α-glucozidază neutră, NAG), funcției prostatei (acid citric) și funcției veziculelor seminale (fructoză) au fost evaluați în plasma seminală. Activitatea totală a NAG a fost măsurată utilizând un kit disponibil în comerț EpiScreen Plus α-glucozidază (FertiPro, Beernem, Belgia) conform instrucțiunilor producătorului. Pentru a cuantifica cantitatea de fructoză din plasma seminală, testul fructozei (FertiPro, Beernem, Belgia) a fost utilizat conform instrucțiunilor producătorului. Conținutul de acid citric din plasma seminală a fost măsurat folosind testul acidului citric (FertiPro, Beernem, Belgia) conform instrucțiunilor producătorului.

analize statistice

Rezultate

Un total de 36 de bărbați caucazieni sănătoși, cu o vârstă medie de 22 ± 3 ani, au fost incluși în acest studiu. Nu au fost raportate sarcini anterioare, comorbidități medicale, medicamente sau consum de droguri în rândul participanților la setul de date. O analiză descriptivă a rezultatelor este prezentată în Tabelul 1. Numai rezultatele semnificative statistic sunt descrise mai jos (Fig. 2, Tabelul 2). Toate diferențele perechi între timpul de studiu (TP) sunt descrise în tabelul suplimentar S1.

Complot cutie cu alcool ( A. ) și consumul de nicotină ( B. ), parametrul de bază al materialului seminal ( C. - K ), markerul stresului oxidativ ( L. ) și funcția epididimului ( M. ) și glandele sexuale accesorii ( și O ) la momente diferite (TP). Valorile P din testele cu probe asociate sunt rezumate în Tabelul 2.

Influența sărbătorilor academice asupra parametrilor de bază ai materialului seminal și a markerilor de stres oxidativ ai spermei

Consumul de alcool pe zi a crescut de peste opt ori între TP1 și TP2. În TP3, nivelurile de consum de alcool au scăzut la valorile de bază (TP1) (Fig. 2A; Tabelul 2). În TP2, consumul de nicotină a crescut semnificativ în comparație cu TP1 (de 2 ori) (2B; Tabelul 2).

S-au observat diferențe în parametrii de bază ai semințelor (Fig. 2C-K; Tabelul 2). Volumul materialului seminal a arătat o scădere semnificativă în comparație cu TP-urile (18% de la TP1 la TP2; 19% de la TP2 la TP3; 33% de la TP1 la TP3) (FIG. 2C, Tabelul 2). Concentrația de spermă și numărul total de spermatozoizi din ejaculat au scăzut semnificativ de la TP1 la TP3 (20% și respectiv 52%) (2D și E; Tabelul 2). Procentul de motilitate progresivă a scăzut de la TP1 la TP2 (15%) (Fig. 2F; Tabelul 2). Procentul de spermă mobilă neprogresivă a crescut peste TP (40% de la TP1 la TP2; 50% de la TP1 la TP3) (FIG. 2G; Tabelul 2). Procentul de spermatozoizi imotili a scăzut semnificativ de la TP1 la TP2 (14%) (FIG. 2H; Tabelul 2). În ceea ce privește morfologia spermei, procentul de spermă normală a fost semnificativ mai mare în TP1 comparativ cu TP2 și TP3 (2I; Tabelul 2). În special, erorile capului și ale piesei centrale au fost mai mari în TP2 decât în TP1 și TP3 (Fig. 2J și K; Tabelul 2).

Nivelul de 3-nitrotirozină (3NT) în spermă a fost singurul marker de stres oxidativ care a prezentat o schimbare semnificativă (Fig. 2L; Tabelul 2). În TP2 nivelurile de reziduuri de tirozină, care suferă de nitrație, au fost de 1,4 ori mai mari decât în TP3.

Influența sărbătorilor academice asupra funcției epididimului și a glandelor sexuale accesorii

A existat o scădere semnificativă a activității α-glucozidazei neutre (NAG) în ejaculată de la TP1 la TP3 (46%) și de la TP2 la TP3 (35%) (FIG. 2M; Tabelul 2). În ceea ce privește cantitatea totală de fructoză din ejaculat, a existat, de asemenea, o scădere semnificativă de la TP1 la TP3 (28%) și de la TP2 la TP3 (23%) (2N; Tabelul 2). Cantitatea totală de acid citric în ejaculat a fost semnificativ mai mică în TP3 comparativ cu TP1 (36%) (2O; Tabelul 2).

discuţie

Diversi factori de stil de viață au fost legați de problemele de reproducere masculine 5, 6, 16, 17. Cu toate acestea, studiile privind efectele substanțelor toxice asupra spermatozoizilor sunt controversate și adesea părtinitoare 5, 18, 19. Pentru a depăși aceste probleme, festivitățile academice au fost folosite ca model de studiu, deoarece numeroase modificări ale stilului de viață au avut loc simultan în decurs de 7 zile (Fig. 1). Acest model oferă condiții excepționale pentru studierea efectelor modificărilor acute ale stilului de viață asupra unei populații tinere și sănătoase.

Studiul nostru arată că consumul acut de alcool și țigări, împreună cu alte comportamente abuzive la care au fost expuși voluntarii în timpul săptămânii academice, au produs efecte semnificative timpurii (SP2) și târzii (SP3) pe termen scurt asupra calității materialului seminal (Figurile 2 și 3). . Așa cum era de așteptat, consumul de alcool și țigări a crescut în timpul sărbătorilor academice comparativ cu nivelurile observate cu o săptămână înainte și trei luni după sărbătorile academice (Fig. 2). Această schimbare bruscă a stilului de viață a fost asociată cu efecte dăunătoare asupra calității materialului seminal, atât timpuriu cât și târziu. Volumul de spermă, concentrația spermatozoizilor, numărul total de spermatozoizi, motilitatea progresivă și morfologia normală au fost scăzute împreună cu activitatea NAG și cantitatea de fructoză și acid citric din ejaculat. În plus, procentul de spermă neprogresivă și imobilă a crescut împreună cu valorile de nitrație a proteinelor (Fig. 2 și 3).

S-a raportat că consumul cronic de alcool și țigări poate duce la funcționarea defectuoasă a glandelor accesorii 20, 21. Rezultatele noastre sugerează că modificările acute ale stilului de viață au un efect negativ pe termen scurt asupra funcției epididimului și a glandelor sexuale accesorii, care se reflectă și într-o scădere a volumului de material seminal în TP-urile.

Prezentul studiu arată, de asemenea, că modificările acute ale stilului de viață, în principal datorită consumului crescut de alcool și țigări, au un impact semnificativ asupra morfologiei spermei. La o săptămână (TP2) și 3 luni (TP3) după modificările acute ale stilului de viață, s-au observat un număr crescut de defecte ale capului și ale secțiunii medii și o proporție redusă de spermă morfologic normală, ceea ce indică un efect asupra spermatozoizilor morfologic maturi în epididim și asupra formării spermei în testicule. se poate închide (Fig. 2). Un studiu a arătat că foarte puțini bărbați alcoolici sunt normozoospermici, ceea ce amplifică efectele nocive ale alcoolului asupra morfologiei spermei 5. Atât concentrația de spermatozoizi, cât și procentul de spermatozoizi morfologic normali scăzuseră la 3 luni după sărbătorile academice, sugerând că procesul de spermatogeneză a fost afectat.

Valoarea informativă a studiului este limitată de dimensiunea totală relativ mică a eșantionului și de riscul de clasificare greșită datorită utilizării informațiilor retrospective privind expunerea la alcool, țigări și droguri. De asemenea, trebuie luată în considerare tendința de selecție, deoarece toți voluntarii erau caucazieni. Mai mult, nu putem exclude faptul că rezultatele noastre se datorează unor factori de confuzie nemăsurați, inclusiv dietă, modificări ale ritmului circadian, exerciții fizice și stres.

Datorită comportamentului obișnuit al populației la sărbătorile academice, a fost foarte dificil să recrutezi subiecți care nu și-au schimbat stilul de viață în TP2. De fapt, doar 2 persoane din eșantionul nostru îndeplinesc acest criteriu. Cu toate acestea, se poate observa că tendința generală a rezultatelor sugerează că modificările stilului de viață au un efect negativ asupra calității materialului seminal. Dacă rezultatele s-ar datora diferențelor naturale din analiza materialului seminal, s-ar aștepta un model aleatoriu de schimbare.

Dimensiunea minimă a eșantionului nu a fost calculată din cauza lipsei informațiilor despre populație. Cu toate acestea, dimensiunea setului de date a fost considerată adecvată, deoarece teorema limitei centrale a permis distribuirea variabilelor să aproximeze o distribuție normală.

Acest studiu a contribuit la o mai bună înțelegere a fiziopatologiei care stă la baza deteriorării calității materialului seminal cauzată de modificările acute ale stilului de viață. Acest lucru sugerează că consumul deosebit de mare de alcool și țigări este asociat cu o calitate redusă a materialului seminal la bărbații tineri sănătoși și că are un efect negativ asupra tuturor parametrilor materialului seminal. Creșterea stresului oxidativ asupra spermei și afectarea funcției epididimului și a glandelor sexuale accesorii. Prin urmare, bărbaților sănătoși li se poate spune că schimbările acute ocazionale ale stilului de viață pe termen scurt le afectează fertilitatea. Sunt necesare mai multe studii pentru a înțelege dacă calitatea materialului seminal se recuperează sau dacă modificările acute ale stilului de viață au efecte pe termen lung.

informatii suplimentare

Cum se citează acest articol: Vieira Silva, J. și colab. Studiul efectelor pe termen scurt ale consumului crescut de alcool și țigări asupra calității materialului seminal al tinerilor sănătoși. Știință. reprezentant. Al 7-lea, 45457; doi: 10, 1038/srep45457 (2017).

Nota editorului: Springer Nature rămâne neutru în ceea ce privește cererile de jurisdicție din hărțile publicate și conexiunile instituționale.

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Tabel suplimentar S1

Observații

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord cu termenii noștri de utilizare și cu regulile comunității. Dacă găsiți ceva abuziv sau care nu respectă termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind inadecvat.