Tilman Graulich
Stereol. Investigație d. Plămânii și Traheea b. d. tumora-kach. Mouse VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 [email protected] www.doktorverlag.de ISBN: 978-3-8359-6616-1 9 7 8 3 8 3 5 Tilman Graul édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAG Tilman Graulich Examinări stereologice ale regiunii de schimb de gaze ale plămânilor și inervația traheei în șoarecul cachectic tumoral Disertație inaugurală pentru obținerea diplomei de doctor în medicină în secția medicală a Universității Justus Liebig Giessen 9 6 6 1 6 1 ediție scientifique VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG
Opera este protejată prin drepturi de autor în toate părțile sale. Responsabilitatea legală pentru întregul conținut al acestei cărți revine exclusiv autorului acestei lucrări. Orice utilizare nu este permisă fără acordul scris al autorului sau al editorului. Acest lucru se aplică în special reproducerilor, traducerilor, microfilmării și stocării și procesării acestora prin sisteme electronice. Prima ediție 2017 Toate drepturile rezervate. Nicio parte a acestei publicații nu poate fi reprodusă, stocată într-un sistem de recuperare sau transmisă, sub orice formă sau prin orice mijloace, electronice, mecanice, fotocopiate, înregistrate sau altfel, fără permisiunea prealabilă scrisă a autorului sau a editorilor. Prima ediție 2017 2017 de VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Tipărit în Germania édition linguistique VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 email: [email protected]
Investigații stereologice ale regiunii de schimb de gaze ale plămânilor și inervația traheei la șoarecul cachectic tumoral DISERTATURA INAUGURALĂ pentru obținerea diplomei de doctor în medicină la Facultatea de Medicină a Universității Justus Liebig din Giessen prezentată de Tilman Graulich de la Bochum Hannover 2017
De la Institutul de Anatomie și Biologie Celulară al Facultății de Medicină de la Universitatea Justus Liebig din Giessen Director executiv: Prof. Dr. Evelyne Baumgart-Vogt Recenzor 1: Prof. Dr. Mühlfeld al doilea recenzor: Prof. Dr. Ziua disputelor Weißmann: 04.09.2017 II
Cuprins Pagina 1. Lista abrevierilor VI 2. Lista figurilor VIII 3. Lista tabelelor IX I. Introducere 1 I.1. Anatomia căilor respiratorii inferioare 1 I.1.1. Funcția și metabolismul surfactantului 4 I.2. Inervația căilor respiratorii 6 I.3. Plămânii în malnutriție și anorexie 7 I.4. Cașexie tumorală 9 I.5. Cachexia tumorală și căile respiratorii inferioare 10 I.6. Scopul lucrării 11 II.Material și metode 12 II.1. Experiment pe animale 12 II.2. Pregătirea și prelevarea de probe 12 II.2.1. Prelevare pentru microscopie 12 II.2.2. Spălarea bronhoalveolară (BAL) 13 II.3. Pregătirea probelor 13 II.3.1. Prelevarea de probe pentru microscopie 13 II.3.1.1. Pregătirea probelor pentru microscopie cu lumină 14 II.3.1.2. Pregătirea probelor pentru imunohistochimie 15 II.3.1.3. Pregătirea probelor pentru microscopie electronică (EM) 17 II.3.1.3.1. Pregătirea probelor pentru microscopia electronică cu transmisie convențională (TEM) 17 II.3.1.3.2. Pregătirea probelor pentru microscopie imunoelectronică (preîncorporare) 18 II.3.1.3.3. Pregătirea probelor pentru microscopie electronică cu scanare (SEM) 19 II.3.2. Stereologie 19 III
II.3.2.1. Volumele 21 II.3.2.2. Suprafețe 23 II.3.2.3. Lungimi 24 II.3.3. Pregătirea probelor pentru centrifugarea diferențială 26 II.4. Statistică 26 III. Rezultate 27 III.1. Greutatea corporală și volumele pulmonare 27 III.2. Microscopie 27 III.2.1. Microscopie calitativă 27 III.2.1.1. Microscopie cu lumină 27 III.2.1.2. Microscopie de imunofluorescență 30 III.2.1.3. Epiteliul traheal în microscopia electronică cu 33 de scanare (SEM) III.2.1.4. Microscopie electronică cu transmisie calitativă (TEM) 34 III.2.2. Microscopie cantitativă sau stereologie 35 III.2.2.1. Plămâni 35 III.2.2.1.1. Volumul regiunii de schimb de gaze/parenchim 35 III. 2.2.1.2. Suprafața alveolară 36 III. 2.2.1.3. Celule epiteliale alveolare tip II 36 III. 2.2.1.4. Relația LB cu epiteliul alveolar 37 III. 2.2.2. Traheea 38 III. 2.2.2.1. Inervație 38 III. 2.2.2.2. Compoziția peretelui traheal 39 III.3. Centrifugarea diferențială pentru determinarea surfactantului 41 IV. Discuție 42 IV.1. Metodologie utilizată 42 IV.1.1 Configurarea experimentului, eșantionare, fixare 42 IV.1.2. Stereologie 46 IV.1.2.1. Eșantionarea 46 IV
IV.1.2.2. Volumele de referință 47 IV.1.2.3. Sisteme de testare a stereologiei 48 IV.1.2.4. Orientarea țesutului 50 IV.1.3. Imunohistochimie 51 IV.2. Discutarea rezultatelor 52 IV.2.1. Suprafața alveolară 52 IV.2.2. Metabolismul surfactantului 58 IV.2.3. Analiza sângelui 60 IV.2.4. Inervația traheală 61 IV.2.5. Morfologia traheei 63 IV.2.5.1. Cartilaj 63 IV.2.5.2. Epiteliu 63 V. Rezumat 65 VI. Rezumat 67 VII. Referințe 69 VIII. Prezentare generală a materialelor 82 VIII.1 Tampoane și soluții 82 IX. CV 85 X. Mulțumiri 86 XI. Declarația 87 XII. Publicații proprii 88 V
1. Lista abrevierilor: Fig. Figura ABCA3 Casetă de legare ATP Celule AE1 Celule epiteliale alveolare tip I Celule AE2 Celule epiteliale alveolare tip 2 AK Tip anticorp Arterie BAL Spălare bronchioalveolară BGW Țesut conectiv BMP Oase Proteină morfogenă Bronchius CGRP Calcitonină-genă-corelată-peptidă Microscopie cu scanare laser DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium FBS Fetal Bovine Serum FEV Volum expirator forțat FGF Fibroblast Growth Factor FITC Fluorescein Isothiocyanate HRP Horseradish Peroxidase von Engl. Horsradishperoxidase KG Grup de control KGF Keratinocite Factor de creștere LA Agregate mari LB Corpuri lamelare din engl. Corpuri lamelare LLC Carcinom pulmonar Lewis Microscopie ușoară LM KGF Factor de creștere a keratinocitelor Mito Mitocondrii NANC Neadrenergici non-colinergici Nucleus nzz Celule neciliente PBS Fosfat tampon Salină PDGF Factor de creștere derivat din trombocite VI
PFA PPAR-γ Ref RF SA SD SMC SP SP-A SP-B SP-C SP-D SURS Tab TEM TF TG TGF-β TK TNF-α UA + O UD VEGF ad VIP ZP zz Paraformaldehidă Peroxisom Proliferator activat Receptor- γ referință colorare Richardson Agregate mici celule musculare netede semi-subțiri din engl. Proteina tensioactivă a celulelor musculare Proteina surfactantă A Proteina surfactantă B Proteina surfactantă C Proteina surfactantului D Uniform sistematic Masă de eșantionare aleatorie Transmisie Microscopie electronică Câmpuri de testare Grupa tumorală Factor de creștere transformant β Tumorkachexie Factor de necroză-α Uranyl Acetat Growth Vascular Endocromul de vascularizație Vascular
2. Lista figurilor: Figura I: Structura plămânului folosind exemplul șoarecelui 4 Figura II: Eșantionarea probelor de plămâni pentru microscopie 14 Figura III: Greutatea corporală a animalelor la începutul (A) și la sfârșitul (B) experimentelor 27 Figura IV: Microscopie ușoară comparativă Reprezentarea parenchimului pulmonar cu alveole și capilare 29 Figura V: Imunofluorescență reprezentare microscopică a inervației traheei 30 Figura VI: Imunofluorescență reprezentare microscopică a traheei cu reconstrucție 3D a suprafeței 32 Imaginile microscopului electronic cu scanare ale epiteliului traheal 34 Figura IX: Imaginile microscopului electronic de transmisie ale peretelui traheal 35 Figura X: Prezentare generală a datelor stereologice asupra sistemului surfactant după 21 de zile 38 Figura XI: Lungimea axonului fibrelor nervoase conținute în trahee după 21 de zile 39 Figura XII: Compararea sistemelor de eșantionare stereologică 47 Figura XIII: Diagrama factorilor de creștere măsurați și efectele posibile ale acestora 57 VIII
3. Lista tabelelor: Tabelul I: Anticorpii utilizați (AK) 16 Tabelul II: Anticorpii (AK) pentru pre-încorporare 19 Tabelul III: Numărul de animale per grup pe valoare stereologică examinată 20 Tabelul IV: Prezentare generală a densităților și volumelor de volum determinate 22 Tabelul V: Prezentare generală a metodei de măsurare pentru determinarea densității volumului 22f. Tabelul VI: Prezentare generală a densităților și suprafețelor determinate 24 Tabelul VII: Prezentare generală a metodei de măsurare pentru determinarea densității suprafeței 24 Tabelul VIII: Volumul plămânilor și regiunea de schimb de gaze (parenchim) 36 Tabelul IX: Suprafața alveolelor 36 Tabelul X: Date stereologice ale celulelor epiteliale alveolare tip II 37 Tabelul XI: Date stereologice privind inervația traheei 39 Tabelul XII: Date stereologice ale peretelui traheal 40 Tabelul XIII: Obiecte în spațiu, reprezentarea lor în secțiune și sisteme de testare stereologice 49 Tabelul XIV: PCR cantitativă a unor factori de creștere în probele pulmonare 56 Tabelul XV: Analiza sângelui în TG și KG 61 IX