Un model de autolimitare a leziunilor pulmonare acute prin protocol unilateral de instilație a acidului intra-bronșic

rezumat

Instilarea selectivă a acidului intra-bronșic în plămânul stâng la șoareci are ca rezultat leziuni pulmonare acute uniale și autolimitate, care modelează sindromul de detresă respiratorie acută umană (ARDS) indus de aspirația acidului gastric.

Abstract

Instilația intra-bronșică selectivă a acidului clorhidric (HCl) în tuburile bronșice stângi ale trunchiului principal murin provoacă leziuni acute ale țesuturilor cu constatări histopatologice similare cu sindromul de detresă respiratorie acută umană (ARDS). Edemul alveolar rezultat, deteriorarea barierei alveolare-capilare și infiltrarea leucocitelor afectează în principal plămânul stâng, păstrând plămânul drept drept control nevătămat și permițând animalelor să supraviețuiască. Acest model de leziuni pulmonare acute autolimitate permite investigarea mecanismelor de rezoluție a țesuturilor, cum ar fi eferocitoza macrofagelor de la neutrofile apoptotice și restabilirea integrității barierei alveolare-capilare. Acest model a identificat roluri importante pentru agoniștii de rezoluție, inclusiv mediatori specializați pentru rezoluție (SPM), oferind o bază pentru dezvoltarea de noi abordări terapeutice pentru pacienții cu RPS.

Introducere

Disregularizarea răspunsului imun înnăscut în timpul fazei exudative contribuie la apariția acută a SDRA și a insuficienței respiratorii asociate 1. Semnalizarea puternică a mediatorului proinflamator orchestrează răspunsurile imune inițiale, ceea ce duce la întreruperea barierei alveolare-capilare, edem alveolar difuz și infiltrarea neutrofilelor la locul afectării țesutului pulmonar 4. În ARDS, semnalele de frânare ineficiente pentru inflamația acută predispun la insuficiență pulmonară și poate întârzia catabaza la timp a țesutului pulmonar rănit.5 În acest scop, studiul preclinic asupra mecanismelor endogene de inițiere și rezoluția pro-ARDS poate descoperi noi strategii terapeutice. O astfel de investigație necesită modele experimentale auto-limitate in vivo de leziuni pulmonare acute care seamănă foarte mult cu caracteristicile ARDS umane, permițând interogarea mecanismelor care stau la baza fazelor de inițiere și rezoluție a leziunii tisulare.

Modelul de șoarece prezentat aici produce leziuni pulmonare acute directe care demonstrează procesele patobiologice cardinale ale ARDS exudativ, și anume întreruperea barierei alveolare-capilare și infiltrarea neutrofilelor. Metoda se bazează pe instilarea intra-bronșică selectivă a HCl prin canulare a bronhiului trunchiului stâng, localizând leziunea și răspunsul inflamator la plămânul stâng; plămânul drept nevătămat poate fi utilizat ca control intern pentru anumite determinări ale afectării și inflamației țesuturilor. În plus, leziunile pulmonare unilaterale nu sunt fatale și prezintă un program de rezolvare. Aceasta oferă o fereastră distinctă în rezoluția inflamației pulmonare care poate fi exploatată pentru a identifica mediatori și mecanisme celulare endogene de rezolvare pro și pentru a deschide noi căi terapeutice pentru ARDS, care pune accent pe rezolvarea fiziologiei și farmacologiei.

Protocol

Toate procedurile legate de animale de mai jos au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Spitalul Brigham și pentru femei (Protocolul nr. 2016N000356).

NOTĂ: Tehnica sterilă a fost urmată pentru toate procedurile de supraviețuire. Pentru fiecare intervenție chirurgicală a fost stabilit un draper steril folosind un prosop steril, în timp ce chirurgii purtau mănuși chirurgicale sterile, pălării, măști și paltoane de laborator curate. Toate instrumentele chirurgicale au fost sterilizate folosind o autoclavă, iar sterilitatea a fost menținută folosind un sterilizator cu mărgele.

1. Prepararea HCI 0,1 N

2. Instilația intra-bronșică selectivă a HCl

3. Îngrijirea postoperatorie

  1. Odată ce incizia este închisă, plasați mouse-ul peste partea stanga pe un tampon cald de încălzire până când șoarecele se recuperează de la anestezie. Începeți să monitorizați mouse-ul pentru durere și nivelul de activitate înainte de a-l readuce în carcasă normală.
    NOTĂ: Buprenorfina trebuie administrată la 0,1 mg/kg subcutanat la fiecare 6-12 ore în primele 24 de ore. Dacă este prezentă durere persistentă, continuați regimul analgezic până când durerea dispare.

4. Spălarea bronhoalveolară pulmonară întreagă (BAL) și imunofenotiparea leucocitelor

5. Evaluarea permeabilității barierei aeriene utilizând colorantul albastru al lui Evan (DME)

  1. Injectați colorantul albastru al lui Evan (40 mg/kg) intravenos cu 30 de minute înainte de eutanasie.
  2. Eutanasiați mouse-ul folosind supradozaj cu ketamină/xilazină (pasul 4.1).
  3. Pentru a măsura integritatea barierei alveolare, urmați pașii 4.2-4.9 pentru colecția BAL.
  4. Transferați 100 µl de BALF pe o microplacă cu 96 de godeuri în partea de jos, împreună cu 100 µl de standarde EBD duplicate. Folosiți PBS -/- ca gol.
  5. Utilizați un cititor de microplăci pentru a măsura absorbția BALF la 620 nm și 740 nm. Utilizați absorbția la 740 nm pentru a corecta contaminarea hemului în probe 7 .
  6. Pentru a măsura integritatea barierei vasculare, perfuzați plămânii injectând încet 5 ml de PBS rece/cu gheață -/- prin ventriculul drept al inimii. Îndepărtați plămânul stâng.
  7. Uscați plămânul stâng 72 de ore la 58 oC pentru a elimina excesul de apă.
  8. Tratați țesutul pulmonar uscat ca în Radu și Chernoff 2013 8 și măsurați absorbanțele la 620 nm și 740 nm.