Un model de placă aterosclerotică Ex Vivo umană pentru a studia protocolul biologiei leziunilor (tradus în germană)

rezumat

Ateroscleroza este un proces inflamator cronic. Acest manuscris ilustrează un model ex vivo ușor de utilizat pentru a examina plăcile proaspete carotide sau coronariene. Modelul ex vivo permite investigarea posibilelor substanțe din mediul inflamator în leziunile arteriosclerotice umane și rezultatele pot fi investigate cu diferite metode.

aterosclerotică

Abstract

Introducere

Ateroscleroza ca boală inflamatorie cronică este una dintre principalele cauze de deces în țările industrializate 1/2. Complicațiile aterosclerozei, în special sindromul coronarian acut, au fost legate de ruperea leziunilor vulnerabile, ducând la aterotromboză și ocluzie vasculară 3. Imunitatea înnăscută și dobândită pare să fie implicată în toate etapele 2.4-5 aterogenezei. Deși s-au făcut progrese semnificative în tratamentul infarctului, prevenirea eficientă a aterosclerozei și a efectelor secundare cardiovasculare sunt încă nerezolvate. Astfel, studierea biologiei lezionale este importantă pentru creșterea cunoștințelor noastre despre fiziopatologia aterosclerozei și pentru a permite identificarea de noi ținte terapeutice și dezvoltarea de noi terapii.

În multe cazuri, modelele murine sunt utilizate pentru a studia fiziopatologia bolilor specifice. Cu toate acestea, studierea aterogenezei folosind modele de șoarece este însoțită de mai multe limitări: (1) De obicei, șoarecii aterosclerotici primesc o dietă bogată în colesterol. Nivelurile de colesterol din aceste modele nu pot fi comparate cu cele de la pacienții cu niveluri crescute de colesterol seric 6. (2) Există diferențe semnificative între sistemul imunitar murin și cel uman; astfel Foxp3 este un marker specific pentru celulele T de reglare a șoarecilor, în timp ce expresia umană Foxp3 în celulele T umane nu conferă neapărat un fenotip de reglare 7. De asemenea, paradigma Th1/Th2 ca la om nu este definită pentru celulele T de șoarece. Celule complet transferabile. (3) Un set de markeri care sunt utilizați pentru a identifica monocitele și macrofagele murine, cum ar fi F4/80 și markerii modelelor de activare clasice (M1) vs. alternative (M2) care nu sunt prezente în celulele mieloide umane 8. (4) Expresia genică a monocitelor murine și umane în sângele periferic sa dovedit a fi esențială 9.

Astfel, pentru a ne crește înțelegerea proceselor inflamatorii cronice în ateroscleroza umană, trebuie să folosim modele de lucru cu țesut uman, sânge sau celule. Aici descriem un model de cultură a țesutului plăcii umane care permite investigarea posibilelor substanțe noi în conceptul de biologie lezională inflamatorie umană.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Pregătiți mediu după cum urmează

Mediu de cultură: mediu RPMI.
Devine 10% ser fetal de vițel (FCS).
Cu 100 U/ml penicilină G și 100 g/ml streptomicină.

2. Păstrați cilindrii de plăci proaspeți până la utilizare

Operația de endarterectomie carotidă a pacienților cu sau fără simptome ischemice (accident vascular cerebral, atac ischemic tranzitor) cu o stenoză carotidă semnificativă sunt efectuate de chirurgii vasculari și endarterectomia cardiacă coronariană în timpul operațiilor de bypass coronarian de către chirurgii cardiaci. Plăcile carotide/coronare trebuie îndepărtate în bloc pentru a păstra structura plăcii așa cum este descris mai sus 5.
După eradicarea plăcii, puneți proba într-un tub umplut cu mediu și păstrați-o pe gheață (placa trebuie acoperită complet cu mediu) până la utilizare.

4. După timpul specificat de recoltare a pieselor de țesut din placă

Înghețarea șoc a pieselor de placă pentru izolarea ARNm și sinteza ADNc (pentru informații detaliate a se vedea secțiunea 5 Proto-col).
Supernatantul și stocat la -20 ° C pentru analiza ELISA.
Pentru western blot, smash și țesut de placă de liză. Se filtrează lizatul printr-un dispozitiv de filtrare centrifugă de 0,65 µm și 0,1 µm.
Încorporați țesutul plăcii în țesut-tec sau parafină pentru colorarea imunohistochimică.

5. Extracția ARN din bucăți de placă cultivate

Folosiți un TissueLyser pentru omogenizare.
Izolați ARN-ul folosind kitul (vezi Tabelul cu materiale) conform instrucțiunilor producătorului.
Determinați cantitatea și calitatea de ARN din probe folosind un spectrofotometru.
Utilizați kitul ADNc Boehringer pentru transcriere inversă conform instrucțiunilor producătorului.
Pentru PCR cantitativă, utilizați, de exemplu, kitul Roche PCR în timp real cu SYBR Green.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

În primul rând, arătăm modificări dependente de timp ale compusului inflamator al leziunilor aterosclerotice cultivate nestimulate, prin reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qRT-PCR) (Ilustrația 1) analizate. O creștere a activității mediului lezional inflamator poate fi observată în timpul cultivării plăcii. Nu s-a găsit nicio diferență după 3 ore față de fără cultură (datele nu sunt prezentate). După 8 ore de cultură a plăcii, am găsit doar o ușoară reglare ascendentă a unor molecule, cum ar fi IL-6, dar nu a TNF-a și IFN-g, în timp ce după 24 de ore a existat o reglare ascendentă a diferitelor molecule precum TNF a, IL-6 și IFN- G. În special, cu cât timpul de cultură a plăcii este mai mare, cu atât variația expresiei moleculare este mai mare.

În al doilea rând, pentru a demonstra fezabilitatea influențării mediului inflamator în leziunile aterosclerotice, prezentăm rezultatele bucăților de placă cu 1 µg/ml LPS timp de 3 ore, măsurate prin qRT-PCR (Figura 2) incubat. Piesele de placă nestimulate au servit drept controale negative. Am constatat că LPS a indus o creștere semnificativă a gradului de activare a compusului inflamator în cadrul leziunilor aterosclerotice. Diverse citokine (IL-6, TNF-a etc.)., Fig. 2A-B), Chimiochine (CCL2 etc., nereprezentate), aderență (ICAM-1, nereprezentate), destabilizare a plăcii (matrice metalopeptidază 9 (MMP9), neprezentate) și molecule protrombotice (factor von Willebrand, 2C, Factorul de țesut neprezentat) a fost reglementat de incubația LPS.

În al treilea rând, pentru a evalua cantitatea de proteine, nivelurile de leziuni cultivate au fost analizate prin ELISA și perturbarea țesuturilor plăcii prin Western blot (Figura 3D). În Figurile 3A-C arătăm analiza ELISA a IFN-g, MCP-1 și TNF-a în supernatantul probelor de cultură incubate cu LPS sau martor timp de 8 ore. În plus față de analiza Western blot (fosforilată), țesutul ERK 1/2 spart și lizat, fie cu control stimulat de LPS și utilizat în Figura 3D afișate.

Discuţie

Aici prezentăm un model de cultură a plăcii ex vivo pentru a investiga influența substanțelor potențial relevante asupra biologiei leziunilor aterosclerotice. Principalul avantaj al acestor metode ex vivo este posibilitatea de a evalua influența substanțelor menționate asupra celulelor inflamatorii și a interacțiunilor lor între căile celulare și inflamatorii și cascadele în cadrul leziunilor aterosclerotice umane. Mai multe metode utile (de exemplu, RT-PCR, Western blot, imunohistochimie, citometrie în flux, ELISA) ajută la crearea unei analize cuprinzătoare a efectelor substanței de interes asupra inflamației leziunii aterosclerotice.

Procesele inflamatorii în ateroscleroza murină sunt bine înțelese, de asemenea, datorită modelelor de șoarece care supraexprimă sau lipsesc anumite gene de interes 11. Cu toate acestea, rezultatele nu corespund întotdeauna îndeaproape cu oamenii 6-9,13. Șoarecii aterosclerotici primesc, de obicei, o dietă cu colEsterol cu un grad ridicat de patologie 6. În plus, se știe că sistemul imunitar dintre oameni și șoareci prezintă diferențe semnificative 9.7. Aici prezentăm un model de cultură a plăcii ex vivo care permite studiul influenței unei substanțe de interes asupra compusului inhibitor în leziunile aterosclerotice umane, așa cum este descris de Niessner și colab. 14 prezentate. În plus, diferite metode suplimentare pot fi utilizate pentru a analiza rezultatele unui experiment de cultură a plăcii comparabil cu studiile murine. Prin urmare, modelul ex vivo deschide posibilitatea de a înlocui studiile in vivo ale șoarecilor în unele cazuri și poate reprezenta o metodă excelentă de punere în legătură a unei supuse molecule de promovare a aterosclerozei în sistemul murin și a traducerii în biologia umană.

Modelul uman ex vivo pentru ateroscleroză nu este comparabil cu experimentele celulare in vitro. Liniile celulare pot fi stocate și cultivate cu ușurință, dar nu sunt fenotipice și funcționale identice cu celulele primare. Celulele proaspete pot fi obținute prin extragerea regulată a sângelui, dar uneori este dificil de cultivat, iar cultura este supusă multor factori. În plus, folosind experimente de cultură celulară in vitro, nu este posibil să se studieze influența moleculelor specifice asupra compusului inhibitor în leziunile aterosclerotice. Astfel, experimentele in vitro sunt importante pentru etapa inițială (translațională) pentru investigațiile de biologie umană, dar nu pentru a analiza în continuare rolul moleculei de interes în conceptul de ateroscleroză umană, în special interacțiunea celulară și influența asupra cascadelor inflamatorii și calea în leziuni aterosclerotice .

Monaco și colab. S-a stabilit un important sistem de cultură pe termen scurt al celulelor izolate din țesutul aterosclerotic uman 15. Ați folosit un amestec enzimatic de colagenază, elastază și DNază. Această metodă permite investigarea experimentelor celulare celulare, analiza căii de semnal și studii de transfer de gene cu vectori adenovirus. Dar rămâne necunoscut modul în care amestecul enzimatic influențează celulele, adică gradul de activare, expresia markerului de suprafață etc. În plus, este îndoielnic dacă rezultatele acestor experimente reflectă procesele reale din leziunile aterosclerotice. În plus, poziția inițială a celulelor va fi distrusă prin amestecarea enzimatică și sistemul de cultură pe termen scurt are aceleași limitări ca și pentru experimentele cu celule in vitro.

Pentru studii specifice de celule sau populație de celule în cadrul unei leziuni aterosclerotice, este posibil să se utilizeze metoda de microdisecție cu captare cu laser. Celula sau compusul celular de interes va fi tăiat din țesut prin utilizarea unui laser în infraroșu sau UV și se pot efectua analize ARN, ADN sau proteine. Microdisecția de captare cu laser nu pare să afecteze celulele, expresia receptorului de suprafață celulară etc. Avantajul metodei este analiza unei celule sau a unui loc de interes în cadrul unei leziuni aterosclerotice. Dar nu este posibilă evaluarea ulterioară a celulelor, precum studiile in vitro.

Modelul ex vivo se bazează pe probe de endarterectomie. Utilizarea plăcilor aterosclerotice obținute de la diferiți indivizi poate avea ca rezultat grade mai mari de compoziție celulară diferențială și, prin urmare, o variație mai mare a nivelurilor de gene/proteine de interes. Prin urmare, este important să se utilizeze leziuni non-fibrosclerotice 10 probe de placă bogate în lipide sau complicate, deoarece răspunsul inflamator este semnificativ mai mic în leziunile fibrosclerotice. Prin urmare, este de mare interes să se evalueze morfologia plăcii înainte de a analiza rezultatele experimentelor de cultură a plăcii.

În plus, fiecare specimen de eșantion conține diferite etape ale dezvoltării/progresiei leziunilor aterosclerotice de la disfuncția endotelială inițială și etapa de acumulare a lipidelor până la dungi de grăsime și dezvoltarea unui nucleu necrotic pentru a rupe plăcile. Astfel, pentru a minimiza eterogenitatea țesuturilor plăcii, este necesar să tăiați marginile care reprezintă, de obicei, etapele timpurii ale aterogenezei.

Nu poate fi exclus faptul că tăierea a indus răspunsuri la leziuni tisulare. Dar experimentele noastre de cultură a țesutului în plăci au arătat o expresie genetică comparabilă a plăcii de țesut cultivat față de placa de țesut necultivat. Deci, acest lucru subliniază că metoda actuală este un instrument bun pentru a studia mediul inflamator în leziunile aterosclerotice.

Piesele KulturPlaque sunt limitate la o perioadă de până la o zi. Dacă țesutul plăcii este cultivat mai mult de o zi, variația rezultatelor crește dramatic. În plus, după 3 zile compoziția și morfologia plăcii se prăbușește.

Există limite pe care trebuie să le aveți în vedere atunci când aplicați acest model. Modelul ex vivo este o metodă bună pentru a studia mediul inflamator în leziunile aterosclerotice. Cu toate acestea, componentele importante din acest context lipsesc. Nu se aplică proprietăți hemodinamice și influențele sistemice sunt complet absente. Mai mult, cu această metodă este posibilă doar studierea modificărilor pe termen scurt, dar lipsește analiza pe termen lung din cauza defalcării morfologiei plăcii.

În concluzie, prezentăm aici o metodă care va fi utilă pentru cercetătorii care doresc să studieze potențiale molecule noi asupra inflamației leziunii aterosclerotice umane. Modelul de cultură a plăcii ex vivo nu suferă de diferențe între sistemul imun murin și cel uman, dar ne oferă posibilitatea de a analiza interacțiunea celulară în contextul leziunilor aterosclerotice și oferim posibilitatea de a investiga cascadele inflamatorii locale și căile lezionale. Metoda de cultură a plăcii ex vivo descrisă aici este ușor de utilizat și este reproductibilă și poate ajuta la identificarea și validarea unor noi mecanisme de boală și ținte terapeutice.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii nu trebuie să dezvăluie niciun conflict.