Un model in vitro pentru măsurarea răspunsurilor imune la malarie în contextul co-infecției cu HIV

Introducere

Co-infecția, infecția cu mai multe infecții simultane, este norma în medii naturale. Co-infecția poate avea un impact major asupra patologiei bolii și asupra managementului clinic al oricărei infecții. În legătură cu co-infecția, vaccinul și eficacitatea medicamentelor, precum și testele de diagnostic pot fi influențate negativ (prezentare generală în 1). În ciuda importanței lor, majoritatea cercetărilor privind agenții patogeni iau în considerare doar infecțiile individuale.

Malaria și HIV-1 (HIV) sunt principalele cauze de morbiditate și mortalitate la nivel mondial. Zonele de malarie și endemicitatea HIV împart o suprapunere geografică largă, punând milioane de oameni în pericol de boli clinice mai severe 2-10. Cele două boli interacționează negativ. La persoanele infectate cu HIV, încărcăturile virale mai mari ale HIV și scăderile tranzitorii ale numărului de celule T CD4 + sunt observate în timpul infecției cu malarie, în timp ce încărcăturile parazitare ale malariei și riscurile de malarie clinică și severă sunt observate la persoanele co-infectate 2,3,5,7 8.10 mai mare. Mecanismele prin care HIV crește severitatea malariei nu sunt pe deplin înțelese și justifică investigații suplimentare.

Aici descriem o metodă prin care malaria și co-infecția cu HIV pot fi studiate in vitro. În special, această metodă permite studierea răspunsurilor imune specifice malariei în legătură cu infecția cu HIV. Protocolul nostru descrie un sistem versatil de cocultură a celulelor mononucleare din sângele periferic proaspăt izolate (PBMC) de la donatori cronici infectați cu HIV și eritrocite parazitate P. falciparum (PfRBC) cultivate in vitro. Efectele terapiei antiretrovirale HIV asupra acestor răspunsuri pot fi, de asemenea, studiate folosind PBMC înregistrate prospectiv de la donatori de HIV (+) înainte și după tratament.

A folosit acest sistem pentru a studia influența infecției cu HIV asupra răspunsurilor imune înnăscute specifice malariei 11,12 și a reușit să determine că răspunsurile IFNy și TNF specifice malariei sunt afectate în celulele NK, celulele NKT, celulele γδ de la donatori de HIV (+) înainte și după terapia antiretrovirală pentru HIV. În plus, am reușit să folosim acest sistem pentru a determina faptul că funcțiile monocitelor sunt afectate și la donatorii de HIV (+), dar se recuperează după terapia antiretrovirală HIV.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Acest protocol necesită recrutarea de donatori pentru ser și RBC pentru a fi utilizați pentru cultura paraziților și pentru HIV (+) și donatori neinfectați pentru izolarea PBMC. Comitetele de revizuire instituționale trebuie să aprobe toate studiile și toți donatorii trebuie să acorde consimțământul informat înainte de extragerea sângelui.

AVERTISMENT: Lucrul cu probe de sânge uman și paraziți ai malariei umane necesită măsuri de precauție. Purtați întotdeauna o haină de laborator, mănuși și lucrați într-un dulap de biosiguranță de nivelul 2. În caz de expunere percutanată accidentală la malaria umană, raportați pentru sănătate și siguranță pentru tratamentul profilactic. Ar trebui făcute și verificări suplimentare de siguranță la fața locului pentru lucrul cu sânge HIV (+). Purtați o haină de laborator de inferență. Mănușă dublă (mănușa superioară ar trebui să fie din latex). Efectuați toată manipularea într-un dulap de biosiguranță de nivelul 2. Nu utilizați sticlă sau obiecte ascuțite. Nu utilizați o pompă cu jet de apă. Puneți toate părțile contaminate ale soluției de virox sau înălbitor timp de cel puțin 1 oră înainte de eliminare.1 ore după aplicare spălați toate suprafețele cu virox și UV. Rețineți că fiecare instituție va avea propriile reglementări specifice de biosecuritate care trebuie respectate. Raportați orice expunere aleatorie la sănătate și siguranță la sângele infectat cu HIV pentru evaluarea și luarea în considerare a unei posibile profilaxii post-expunere.

NOTĂ: Sunt prezente diferite tulpini de paraziți ai malariei P. falciparum. ITG a fost utilizat pentru aceste experimente, dar sunt utilizate diferite tulpini. Instrucțiuni excelente pentru înghețarea și dezghețarea paraziților Plasmodium falciparum sunt disponibile pe site-ul web MR4 13.

1. Creați RPMI-A pentru cultura malariei

  1. Se face RPMI-0 amestecând 950 ml ddH 2 O, 1 pachet de pulbere RPMI-1640, 6 g HEPES, 2 g hidrogen carbonat de sodiu și 1,35 mg hipoxantină.
  2. Decongelați serul uman inactivat la căldură de la doi donatori diferiți. Donatorii AB sunt cei mai buni, dar oricare poate fi utilizat atunci când paraziții sunt crescuți în celulele roșii din sânge (RBC). Măturarea țevilor de amestecat. Dacă serul conține particule sau este centrifugat gros la 2000 rpm și apoi selectați porția de lichid folosind o unitate de filtrare de 0,45 µm.
  3. Folosind un 0,2 µ m filtru unitate filtru 180 ml RPMI-0, 20 ml ser uman (10 ml de la fiecare donator) și 0,5 ml 10 mg/ml gentamicină.
    Notă: Serul uman poate bloca filtrele, astfel încât sunt necesare mai multe unități de filtrare.
  4. Etichetați sticla medie cu RPMI-A, data și sursa serului. Se răcește până când este nevoie. RPMI-A poate deveni tulbure atunci când este răcit. Acest lucru este normal, dar creșterea înnorării este un semn de contaminare.
    Notă: creșterea paraziților în diferite seruri donatoare va varia. Este o idee bună să testați toate loturile de ser uman pentru o bună creștere a paraziților înainte de utilizare.

2. Pregătirea globulelor roșii umane pentru cultura paraziților

Notă: donatorii de sânge trebuie să fie de tip O.

  1. Colectați 7-10 ml de sânge în tuburi de citRate-Dextroză acidă (DCA). Scrieți pe etichetă ID-ul donatorului și data colectării.
  2. Păstrați sângele la 4 ° C până când este necesar. Pentru parazitul din sânge, utilizați culturi în decurs de o lună.
  3. Ștergeți partea superioară a tubului cu etanol 70%. Scoateți cu grijă dopul și aruncați-l. Transferați sângele într-un tub de 15 ml. Rotiți 3 min la 1.000 x g. Îndepărtați plasma prin aspirație.
  4. Expunerea RBC cu un volum egal de RPMI-0 cald. Rotiți timp de 5 minute la 1.000 x g. Îndepărtați pielea de slănină prin aspirație, resuspendare în 5 ml de RPMI-0 și repetați spălarea de încă 2 ori.
  5. Îndepărtați supernatantul și adăugați suficient RPMI-A pentru a produce un amestec de 50% RBC în volum.
  6. A se păstra la 4 ° C până când este necesar.

3. Menținerea culturilor de paraziți

4. Sincronizarea parazitului

NOTĂ: Cu o zi înainte de experiment, sincronizați cultura paraziților prin tratarea cu alanină. Doar paraziții în fază inelară și RBC neinfectați vor supraviețui acestui tratament. Sincronizarea alaninei vă oferă a doua zi o cultură pură de trofozoit, care poate fi utilizată în experimentele de co-cultură. Asigurați-vă că începeți cu o cultură de paraziți care conține majoritatea paraziților inelari.

  1. Se prepară alanină amestecând 8,01 g de alanină (300 mM) și 0,365 g de Tris (10 mM) în 300 ml de ddH 2 O. Se aduce pH-ul la 7,4. Filtrul a fost sterilizat utilizând un 0.2 u m unitate de filtrare.
  2. Soluție de alanină pre-încălzită la 37 o C.
  3. Rotiți cultura parazitului (5 min x 1.000 x g) și îndepărtați mediul.
  4. Pellet în 19 volume de soluție de alanină (1 ml RBC ambalat la 19 ml soluție de alanină). Incubație timp de 15 minute la temperatura camerei.
  5. Rotiți 5 min x 1.000 x g. Supernatantul este aspirat. Se spală o dată în RPMI-0. Supernatantul este aspirat și resuspendat în RPMI-A și instalează hematocrit

3%. La fel ca balonul și reveniți la 37 ° C
Notă: Pentru experimentele de co-cultură este necesar un minim de 5% parazitemie trofozoită, cu 10% parazitemie considerată optimă.

5. Pregătirea parazitului și a eritrocitelor pentru experimentele de co-cultură

  1. Utilizați un raport de 3 PfRBC per PBMC în experimentele de co-cultură pentru a obține un răspuns inflamator. Pentru a calcula PfRBC total, cuantificați parazitemia luând un frotiu subțire de sânge așa cum este descris la 3.5 și hematocrit prin numărarea numărului de globule roșii pe ml de cultură de paraziți cu o cameră de numărare.
    Număr de PfRBC =% parazitemie x RBC total/ml x ml cultură. De exemplu: 10 ml cultură la 10 x 106 RBC/ml și 10% parazitemie este egal cu 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC.
  2. Rotiți cultura parazitului timp de 5 minute la 1000 xg (RT). Mediu aspirat și resuspensie la 6 x 106 PfRBC per ml în RPMI-S + (500 ml RPMI-1640, suplimentat cu L-glutamină și HEPES, 10% FBS inactivat suplimentat termic, 1,5 ml gentamicină, 5 ml piruvat de sodiu 100 mM, 5 ml de aminoacizi neesențiali MEM 10 mM, 5 ml β-mercaptoetanol 5 mM).
  3. Sângele de control (RBC neinfectat de la același donator folosit pentru a deține cultura parazitară), calculat hematocrit și resuspendat în RPMI-S + în același număr de RBC pe ml pe cultura de paraziți.

6. Izolarea celulelor mononucleare din sângele periferic uman (PBMC)

7. Cultura de co-infecție a malariei/HIV

8. Detectarea răspunsurilor imune la malarie

NOTĂ: Efectuați experimente de cocultură timp de 4 zile. Nu este necesară nicio schimbare de mediu în acest timp. Momentul optim va depinde de tipul de celulă de interes și de întrebarea adresată. O incubație de 12 până la 48 de ore este optimă pentru răspunsurile monocitelor la PfRBC, în timp ce răspunsurile limfocitelor au fost observate cel mai bine la 72 până la 96 de ore. Timpii vor trebui optimizați pe baza întrebării experimentale. Perioade mai scurte (2-4 ore) pot fi folosite atunci când interacțiunea dintre PfRBC intacte și PBMC este de interes.

  1. Rotiți placa la 300 × g timp de 3 minute pe celule de pelete. Se colectează 700 μl de supernatant de cultură din fiecare godeu.
  2. Rotiți supernatantul la 1.000 xg timp de 5 minute pentru a evita corpurile străine.
  3. Aliquota a eliminat supernatantul după cum este necesar, etichetați, transferați și fiți la -20 ° C până la analizarea factorilor secretați care trebuie.
  4. Analizați răspunsurile citokinelor/chemokinelor prin ELISA sau prin asamblarea mărgelei (urmați protocoalele sugerate de producător).
  5. Colectați celulele rămase în placă într-o soluție de stabilizare a ARN și folosiți-le pentru analiza expresiei mARN folosind PCR 14-16 în timp real cantitativ.

9. Citometrie în flux intracelular pentru răspunsuri la citokine specifice celulei folosind RBC infectat cu falciparum P. PBMC cocultivat

Notă: După cum sa menționat mai sus, lungimea co-culturii va depinde de tipul de celulă de interes. Dacă sunteți interesat de răspunsurile monocitice, este necesară o perioadă mai scurtă de incubație PfRBC. De mai multe ori pentru răspunsurile înnăscute ale limfocitelor (celule T, celule NK, celule NKT) și cu atât mai mult pentru celulele T CD4 și CD8. Este necesară optimizarea.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Graficele arată nivelurile IFN & ggr; Producerea de celule NKT (Figura 2) pentru a obține populația de celule NKT cu porțile CD56 + CD3 + γδ- (datele nu sunt prezentate). Celulele au fost cultivate timp de 72 de ore înainte de colorare. Odată colorate, 100.000 de celule CD3 + au fost înregistrate pe citometrul de flux pentru a obține populații suficient de mari de celule NK, NKT și γδ (celule de interes). Un minim de 5600 de celule NKT sunt prezentate pe fiecare grafic. Producția de TNF se obține în același mod (datele nu sunt prezentate). Graficele arată clar că IFN & ggr; Producția este mai mică în celulele persoanelor cu HIV (+) față de persoanele cu HIV (-) expuse la PfRBC.

Analiza citometriei în flux este foarte subiectivă. Prin urmare, este important să aveți toate controalele adecvate pentru fiecare experiment (a se vedea Figura 2). Valorile de fond sunt calculate utilizând probele FMO, ceea ce permite o reprezentare reală a colorării citokinei. Celulele stimulate cu PMA/ionomicină au fost utilizate ca martori pozitivi (datele nu sunt prezentate). PMA și ionomicina sunt stimulatori puternici ai producției de citokine a celulelor T. Lipsa producției de IFN în aceste eșantioane ar fi cel mai probabil o problemă cu protocolul de colorare. Cu toate acestea, alte variabile precum viabilitatea celulelor sau reactivii inactivi pot fi, de asemenea, de vină.

vitro
Figura 1. Ilustrația gradientului Ficoll Post Spin Dovezi ale poziției PBMC.

pentru
Figura 2. Producția de IFN γ de către celulele T ucigașe naturale. Diagramele de flux au fost obținute prin închiderea pe celule CD56 + CD3 + γδ (minimum 5.600 de evenimente). Producția de IFNy este detectabilă în proba de HIV (-) cu P. stimulat. falciparum a infectat celulele roșii din sânge. Acest răspuns de citokine nu mai este evident în contextul infecției cronice cu HIV. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Protocolul nostru a fost optimizat pentru a studia co-infecția HIV-malarie cel mai realist in vitro. În primul rând, eritrocitele și serul uman proaspăt sunt necesare pentru cultura parazitului malariei. Acest lucru este esențial pentru menținerea unei populații sănătoase de paraziți ai malariei. Lizatele de paraziți nu pot fi substituite cu paraziți vii, deoarece producția de citokine este mult mai rapidă și mai intensă atunci când se utilizează P. viu. falciparum RBC infectat (PfRBC) 17.18. În plus, activarea tipurilor de celule, cum ar fi celulele NK, necesită PfRBC totale și nu manipulează în mod eficient lizatele de paraziți. Acest lucru se poate datora necesității unui contact direct între PfRBC și leucocite sau se poate datora naturii instabile a ligandului derivat din paraziți care interacționează cu receptorii de suprafață celulară 18. Culturile de malaria PfRBC trebuie, de asemenea, să fie bine sincronizate (Protocolul 4) înainte de experiment. PfRBC sincronizate pentru a îmbunătăți reproductibilitatea datelor experimentale. Deși acest protocol deSchreiber folosește trofozoitul stadiu PfRBC pentru co-cultură, acesta poate fi ușor modificat pentru studiul stadiului inelar PfRBC.

Leucocitele umane sunt infectate artificial cu HIV, iar metoda a fost utilizată în studii efectuate de Malaria-HIV Co-Research Research 20. Cu toate acestea, acest lucru nu modelează disfuncția imună care duce la infecția cronică cu HIV. În acest sistem de co-cultură folosim PBMC izolate de la participanții umani infectați cronic cu HIV-1. Dacă este necesar un studiu pentru participanți, este important să selectați cu atenție acea populație. Criteriile de includere și excludere sunt cruciale pentru a asigura o variabilitate minimă și o reproductibilitate maximă. Criteriile noastre au fost o definiție clară a infecției cronice cu HIV (> 1 an infectate cu HIV, cu scăderea numărului de celule T CD4 + de> 50 celule/mm 3/an) și excluderea oricărei persoane cu o infecție simultană. Acest lucru asigură că rezultatele obținute ar putea fi atribuite efectelor infecției cronice cu HIV și nu altor infecții. În plus, întrucât am fost interesați de răspunsul imun înnăscut la malaria exclusă, am fost donatori care au avut o infecție anterioară a malariei.

Controalele infectate cu HIV sunt utilizate pentru fiecare donator de HIV (+), la fiecare probă, care permite normalizarea datelor. Ar trebui făcută o încercare de a potrivi controalele cu donatorii lor respectivi de HIV (+) pentru cel puțin vârsta, dar de preferință și pentru sex (deși în studiul nostru anterior 12 nu am observat o diferență semnificativă în subgrupurile de celule sau în răspunsurile citokinelor între femei și bărbați Participanți neinfectați cu HIV). Dacă eșantionarea prospectivă este programată, este benefic menținerea aceluiași control infectat cu HIV pentru fiecare timp de eșantionare. Răspunsurile experimentale variază în funcție de mai mulți factori, inclusiv starea de sănătate a PfRBC-urilor, gradul lor de sincronizare, nivelurile de parazitemie și maturitatea PfRBC-urilor și nivelurile de hematocrit. Trebuie avut grijă să păstrăm cât mai multe dintre acestea în armonie între experimente. Normalizarea la un control infectat cu HIV permite unele contabilizări pentru aceste variabile.

A avea celule proaspete este de cea mai mare importanță pentru a evita rezultatele artificiale. Probele de îngheț și dezgheț pot avea un impact semnificativ asupra viabilității celulare 21,22, producției de citokine 23-26 și asupra markerilor fenotipului suprafeței celulare 27.

Dacă monocitele prezintă un interes deosebit, este important ca sticla să nu fie utilizată în protocol. Monocitele de pe sticlă și multe alte materiale plastice 28 trebuie respectate. Folosim pipete, pipete și tuburi din plastic din polipropilenă peste tot pentru a minimiza aderența monocitelor și eliminarea definitivă din populațiile noastre de celule de studiu.

Protocolul descris este unul versatil care poate fi utilizat pentru a studia reacțiile în câteva ore sau zile, în funcție de celulele de interes. Pentru producerea optimă de citokine induse de PfRBC din limfocite înnăscute, am măsurat citometria de flux de bază după 2 sau 3 zile. Când se analizează monocitele, se recomandă puncte de timp mai timpurii (1 sau 2 zile). Acest sistem permite diferitelor tipuri de celule și răspunsuri celulare să se distingă prin citometrie în flux, răspunsuri secretorii să fie măsurate în supernatante celulare și să evalueze profilurile de expresie în ARN extras. În plus, utilizarea anticorpilor pentru a bloca sau neutraliza receptori specifici; citokinele pot fi utilizate în acest sistem pentru a diseca în continuare mecanismele. Am folosit cu succes blocarea receptorilor IL-18 pentru a implica receptorul IL-18 în răspunsurile IFN induse de PfRBC 12. Acest sistem oferă o metodă realistă prin care să evalueze o serie de răspunsuri imune înnăscute la malarie legate de infecția cu HIV.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.