Un senzor ratiometric cantitativ pentru analiza rezolvată în timp a dinamicii

ratiometric

  • Subiecte
  • Abstract
  • introducere
  • Rezultate
  • Dezvoltarea, evaluarea și optimizarea senzorilor într-un sistem de celule de mamifere
  • Caracterizarea și aplicarea senzorului auxometric ratiometric în celulele plantei
  • Discuţie
  • Metodele
  • Construcția plasmidei
  • Cultură de celule de mamifere, transfecție și tratament cu auxine
  • Material vegetal
  • Izolarea protoplastelor, transformarea și prelucrarea auxinelor
  • Analiza expresiei transgenice
  • Inductorii
  • Analiza luminiscenței
  • analize statistice
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • comentarii

Subiecte

  • În
  • Tehnici biologice
  • Inginerie moleculară în plante
  • Fabrica de semnalizare

Abstract

Analiza cantitativă rezolvată în timp a proceselor mediate de auxină în celulele vegetale este încă limitată. Aplicând o abordare sinergică a biologiei sintetice a mamiferelor și plantelor, am dezvoltat un nou biosenzor proporțional lumină-lumină aplicabil pe larg studiului metabolismului, transportului și semnalizării auxinei. Sensibilitatea și proprietățile cinetice ale biosenzorului nostru codificat genetic deschid noi perspective pentru analiza dinamicii extrem de complexe a auxinei în creșterea și dezvoltarea plantelor.

introducere

Pentru a îndeplini aceste cerințe, am dezvoltat un senzor ratiometric chimioluminiscent utilizând interacțiunea mediată de auxină între TIR1 și Aux/IAA. Prin aplicarea senzorului pe bază de degradare într-un sistem de expresie genetică tranzitorie celulară, de exemplu protoplaste, este de așteptat o rezoluție temporală ridicată. În plus, reporterii luminescenți furnizează rapoarte semnal-zgomot ridicate și, prin urmare, sensibilitate ridicată, precum și gama dinamică largă necesară 13, 14. În cele din urmă, efectuarea de cuantificări ratiometrice contribuie la robustețea instrumentului prin corectarea diferențelor specifice celulelor sau a variabilității tipice testelor tranzitorii 15 .

Rezultate

Dezvoltarea, evaluarea și optimizarea senzorilor într-un sistem de celule de mamifere

Pentru a îndeplini specificațiile descrise pentru un senzor de auxină ratiometric, am proiectat o construcție sintetică care conține luciferază licurică fuzionată la o secvență de degradare a auxinei/element de proteine ​​Aux/IAA (modul senzor) și renil lucilază (element normalizator) Fig. 1a). Cele două componente sunt legate printr-o peptidă 16 2A care duce la coexpresia lor stoichiometrică, permițând astfel monitorizarea degradării senzorului dependent de auxină sub forma unei scăderi a luminiscenței cu licurici versus renilă. (F/R) (Fig. 1a).

Prin urmare, am profitat de caracteristicile descrise ale proteinelor Aux/IAA pentru proiectarea rațională a modulelor senzorului: i) s-au dezvoltat o serie de module senzoriale sintetice din diferite proteine ​​Aux/IAA pentru a obține senzori cu diferite intervale dinamice de auxină sensibilitate; ii) pentru a minimiza interferențele potențiale ale senzorului cu componentele de semnalizare auxine endogene, au fost utilizate doar cele 13 secvențe de degron minim de aminoacizi ale diferitelor proteine ​​Aux/IAA.

În consecință, am folosit ca module senzor secvențele de 13 aminoacizi ale a trei Aux/IAA diferite care acoperă o gamă largă de sensibilități, și anume AtIAA17, AtIAA28 și AtIAA31, cu afinități de legare a auxinei de 33 nM., 75 nM și> 1000. nM, respectiv 10. Secvența degron minimă 13-aminoacizi a AtIAA17 coincide cu secvența consensuală a 13-aminoacidului auxin sensibilă a 22 de proteine ​​Aux/IAA 18 (QVVGWPPVRSYRK, senzor min17-Luc, tabelul suplimentar 1), în timp ce cele ale AtIAA28 și AtIAA31 deviază considerabil (PVVGWPPVRSSRR și ARQDWPPIKSRLR, generând senzorii min28-Luc și respectiv min31-Luc, tabelul suplimentar 1). O construcție fără modul senzor a servit drept control negativ al sistemului (Ctrl-Luc, construcție de control, tabelul suplimentar 1).

(a) Caracterizarea inițială a variantelor selectate de senzori în protoplastele A. taliana. La 24 de ore după transformare, protoplastele care exprimă FL-Luc, L2min17-Luc sau Ctrl-Luc au fost incubate timp de 5, 15 sau 45 de minute într-un mediu fără hormoni sau cu complement auxinic (1 μM IAA). Activitățile ratometrice de luciferază sunt prezentate ca medii ± sem (n = 6). Sunt prezentate semnificațiile statistice (testul t cu două cozi, * P 10, 23. Remarcabil, pe lângă sensibilitatea și reactivitatea ridicate, senzorul de secvență consens este capabil să discrimineze diferiți analogi auxinici, dezvăluind astfel potențialul său ca instrument pentru studierea metabolismului, transportului și semnalizării compușilor fiziologic activi.

Discuţie

Monitorizarea cantitativă a auxinei în celulele vii s-a dovedit dificilă. Folosind un sistem de raportare luminiscentă proporțională, am putut dezvolta un biosenzor pe bază de degradare pentru sistemele cu o singură celulă, îndeplinind cerințele de sensibilitate ridicată și rezoluție temporală necesare pentru studiile proceselor complexe mediate de auxină. În acest scop, am aplicat o abordare sinergică de biologie sintetică care cuprinde ingineria și caracterizarea preliminară a senzorului într-un sistem de celule de mamifere heterologice fără interferențe, urmată de aplicarea sa cu succes în celulele vegetale.