UNIVERSITATEA TEHNICĂ DIN MUNICIU - PDF Descărcare gratuită

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Clinică și policlinică pentru chirurgia traumei Klinikum rechts der Isar Șoricelul knockout MDR 2 ca model al osteodistrofiei hepatice Andrea Schmid Copie completă a disertației aprobată de Facultatea de Medicină a Universității Tehnice din München pentru obținerea diplomei academice de Doctor în Medicină Președinte: Prof. univ. Dr. E. J. Rummeny Examinator al disertației: 1. apl. Prof. Dr. A. K. Nüssler, Universitatea Eberhard-Karls din Tübingen 2. Prof. univ. Dr. R. von Eisenhart-Rothe Disertația a fost depusă la Universitatea Tehnică din München la 31 iulie 2012 și acceptată de Facultatea de Medicină la 13 noiembrie 2013.

Cuprins Cuprins Lista abrevierilor 1 Introducere 1 1.1 Introducere generală 1 1.2 Ficat 1 1.2.1 Structura histologică a ficatului 1 1.2.2 Funcții fiziologice ale ficatului 2 1.2.3 Fiziopatologia ficatului 3 1.3 Oasele 4 1.3.1 Structura osoasă, structura osoasă și celulele 4 1.3.2 Remodelarea și funcțiile fiziologice ale osului 5 1.3.3 Dezechilibrul metabolismului osos 6 1.4 Situația studiului 7 1.4.1 Modificări osoase în afecțiunile hepatice cronice 7 1.4.2 Reversibilitatea osteodistrofiei hepatice 8 1.5 Metabolismul vitaminei D 10 1.6 Rolul TGF-β în ficat și metabolismul osos 11 1.7 Model animal alternativ 13 1.8 Întrebare de cercetare 14 2 Material și metode 15 2.1 Proiectarea studiului 15 2.2 Animale testate 16 2.2.1 Tulpini de șoarece 16 2.2.2 Pregătirea preparatului 17

Cuprins 2.2.2.1 Material 17 2.2.2.2 Metodă 17 2.3 Histologie 18 2.3.1 Histotehnologie 18 2.3.1.1 Fixarea probelor de țesut hepatic 18 2.3.1.1.1 Material 18 2.3.1.1.2 Principiu 18 2.3.1.1.3 Execuția fixării țesutului 18 2.3 .1.2 Deshidratarea și încastrarea probelor de țesut hepatic 18 2.3.1.2.1 Material și echipament 18 2.3.1.2.2 Principiul deshidratării și încorporării 19 2.3.1.2.3 Efectuarea deshidratării și încorporarea 19 2.3.1.3 Producerea secțiunilor de parafină 19 2.3. 1.3.1 Material și echipament 19 2.3.1.3.2 Principiul pregătirii secțiunilor 20 2.3.1.3.3 Procedură 20 2.3.1.4 Colorare și montare hematoxilină-eozină 20 2.3.1.4.1 Material 20 2.3.1.4.2 Principiu hematoxilină Colorarea cu eozină 21 2.3.1.4.3 Efectuarea colorării 21 2.3.1.5 Colorarea și montarea tricromului Masson-Goldner 23 2.3.1.5.1 Material și echipamente 23 2.3.1.5.2 Principiul colorării tricromului Masson-Goldner 24 2.3. 1.5.3 Efectuarea colorării 24 2.3.2 Evaluarea microscopică ușoară a secțiunilor hepatice diapozitive 27 2.3.2.1 Dispozitive și software 27 2.3.2.2 Principiul evaluării microscopice cu lumină 27

Cuprins 2.3.2.3 Efectuarea evaluării microscopice ușoare 27 2.4 Determinarea și evaluarea valorilor serice din sânge 28 2.4.1 Determinarea activității enzimei 28 2.4.1.1 Material, echipament și software 28 2.4.1.2 Principiul determinării activității enzimei 29 2.4.1.3 Efectuarea determinării activității enzimei 29 2.4.2 TGF-β -Determinarea concentrației 31 2.4.2.1 Material, dispozitive și software 31 2.4.2.2 Principiu 32 2.4.2.3 Executarea determinării concentrației TGF-β 32 2.5 Măsurători micro-CT 35 2.5.1 Dispozitiv și software 35 2.5.2 Principiul măsurării µct 35 2.5 .3 Efectuarea măsurării µct 35 2.5.4 Parametrii osoși descriși 36 2.6 Cuantificarea expresiei genelor în ficat și țesut osos 36 2.6.1 Izolarea ARN-ului din ficat și țesutul osos 36 2.6.1.1 Material, echipament și software 36 2.6.1.2 Principiul ARN Izolarea 37 2.6.1.3 Executarea izolării ARN 38 2.6.2 Sinteza complementară a ADN-ului (cdna) 40 2.6.2.1 Material și echipamente 40 2.6.2.2 Principiul sintezei ADN-ului 40 2.6.2.3 Execuția g de sinteză cdna 41 2.6.3 amplificare cdna utilizând reacția în lanț a polimerazei (PCR) și separarea electroforetică a ADN 41 2.6.3.1 material, echipament și software 41

Cuprins 2.6.3.2 Principiul electroforezei PCR și gel 42 2.6.3.3 Efectuarea electroforezei PCR și gel 43 2.6.3.4 Grunduri utilizate 44 2.6.4 Evaluarea densitometrică a expresiei genelor 46 2.6.4.1 Software 46 2.6.4.2 Principiul și executarea evaluării densitometrice 46 2.7 Statistică Evaluare 46 2.7.1 Software 46 2.7.2 Efectuarea evaluării statistice 46 3 Rezultate 47 3.1 Evaluarea histologică a țesutului hepatic în timp 47 3.2 Niveluri crescute de transaminază și dehidrogenază în serul sanguin al șoarecilor MDR2 -/- 51 3.2.1 Activitatea enzimatică LDH 51 3.2. 2 Activitate enzimatică ASAT 52 3.2.3 Activitate enzimatică ALAT 53 3.3 Arhitectură osoasă alterată la șoareci MDR2 -/- 54 3.3.1 Arhitectură osoasă corticală 54 3.3.2 Arhitectură osoasă canceroasă 56 3.4 Niveluri serice TGF-β crescute în MDR2 -/- șoareci 60 3.5 Exprimarea redusă a markerilor osoși în șoareci MDR2 -/- mai vechi 61 3.5.1 Expresia OPN în țesutul hepatic 62 3.5.2 Expresia osteocalcinei în țesutul hepatic 63 3.5.3 Expresia OPG în țesutul hepatic 64 3.5.4 Expresia OPN în țesutul osos 65 3.5.5 Expresia osteocalcinei în țesutul osos 66

Cuprins 3.6 Expresia genică a țesutului hepatic al enzimelor și proteinelor de reglare a metabolismului vitaminei D 67 4 Discuție 69 4.1 Limitări și perspective 77 5 Rezumat 80 6 Lista cifrelor 82 7 Lista tabelelor 83 8 Bibliografie 84 9 Anexa 94 9.1 Optimizarea colorării 94 9.1.1 Colorarea HE 94 9.1.2 MGT Colorare 95 9.2 Imagini histologice suplimentare 96 9.3 Informații suplimentare despre primerii utilizați 98 9.3.1 β-actină 98 9.3.2 Osteocalcină 100 9.3.3 Osteopontină 105 9.3.4 Osteoprotegerină 107 9.3.5 MDR2 111 10 Mulțumiri 117

Lista abrevierilor 25 (OH) D 3 25-Hidroxicolecalciferol 1,25 (OH) 2 D 3 1α, 25-Dihidroxicolecalciferol PBC PBS PCR ph PSC PTH RANKL ARN RT RT-PCR sec SMI Taq TBE Tb.N Tb.Sp Tb.Th TGF -β TRAP TV și altele UV V VDBP de ex. ciroză biliară primară soluție salină tamponată cu fosfat reacție în lanț polimerază pondus hidrogenii colangită sclerozantă primară activator al receptorului hormonului paratiroidian pentru factorul nuclear league liga B acid ribonucleic temperatura camerei revers transcriptază polimerază reacție în lanț al doilea Indicele modelului de structură incluzând proteinele care leagă vitamina D de ultraviolete, de exemplu

1 Introducere 13 Fig. 1-5 Mecanism de reglare hipotetică a osteodistrofiei hepatice TGF-β ca posibil regulator Surse grafice: http://www.servier.de/medicalart/skelett-und-knochen/?catselect=5; http://www.servier.de/medicalart/ arterien-physiologische /? catselect = 0; http://www.servier.de/medicalart/verdauungssystem/?catselect=7; 5 august 2011 1.7 Model alternativ animal În general, nu există studii efectuate cu precizie pe termen lung in vivo pe tema osteopatiei hepatice. Într-un astfel de caz, populația de pacienți (tipul, durata, stadiul bolii hepatice; vârsta, sexul, comorbiditățile

2 Material și metode 22 1. Dezechipare Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III 2 min 2 min Roticlear IV 2 min Roticlear V 2 min 2. Rehidratare 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 3 min 99,9 % EtOH III 2 min 90% EtOH 2 min 80% EtOH 2 min adică 2 O 2 min a 3-a colorare soluție de hemaliu acidă conform Mayer 5 min apă curentă de la robinet 15 min eozină G soluție 0,5% apoasă 3 min adică 2 O scurt 4. Deshidratare 80% EtOH 30 sec 90% EtOH I 4 min 90% EtOH II 4 min 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 5 min 5. Clear Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 min 5 min 5 min 3 min Tabelul 2-2 Protocol de colorare hematoxilină-eozină sec: secundă Rezultatele colorării sunt nucleele celulelor albastru-violet, citoplasma roșu pal, fibrele musculare roșii, eritrocitele roșu-portocalii și țesutul conjunctiv colagen roșu (vezi Fig. 2-1 ).

2 Material și metode 23 Fig. 2-1 Exemplu de colorare a hematoxilinei eozinei în ficat, femelă MDR2 -/- șoarece, săptămână de viață 5 2.3.1.5 Colorare și montare tricrom Masson-Goldner 2.3.1.5.1 Material și echipament Rotipuran 100% acid acetic p.a. ROTH (Nr. Cat: 3738.4) EtOH 99,9%, 90%, 80%, 70% Soluție de hematoxilină A conform Weigert Soluție de hematoxilină B conform Weigert Apotheke des MRI ROTH (Nr. Cat: X906.1) ROTH (Nr. Cat. .: X907.1) Verde deschis SF gălbui MERCK (Nr. Cat .: 115941) Portocaliu G MERCK (Nr. Cat: 115925) Poncau Xylidine FLUKA Chemie GmbH (Nr. Cat: 81465) Fucsină acidă FLUKA Chemie GmbH (Nr. Cat. .: 84600) Acid tungstofosforic cristal hidratat cel mai pur MERCK (Nr. Cat: 100582) Roticlear ROTH (Nr. Cat: A538) Gama de stickuri magnetice Agitator magnetic MR Hei-Mix L Echilibru analitic ROTH (Nr. Cat: C267.1) Heidolph Instruments, D-Schwabach Kern și Son GmbH, D-Balingen

2 Material și metode 25 3. Fucsină acidă ponceau xilidine 0,2 grame (g) Ponceau xilidine 0,1 g acid fuchsină 300 ml ddh 2 O 0,6 ml 1% acid acetic 4. Acid fosfotungstic portocaliu G 12 g acid tungstofosforic 3 g portocaliu G 200 ml ddh 2 O 5. verde deschis 0,3 g verde deschis SF gălbui 200 ml ddh 2 O 0,4 ml 1% acid acetic Colorarea menționată a fost efectuată conform unui protocol dezvoltat prin optimizarea culorii (vezi capitolul 9.1 de mai jos) (vezi Tabelul 2-3) . Secțiunile colorate, deshidratate și curățate au fost apoi acoperite cu Roti-Histokitt II în același mod ca secțiunile colorate HE. Amestecul de hematoxilină A și B conform Weigert poate fi păstrat timp de maxim 8 zile la temperatura camerei. Rezultatele colorării sunt nuclee celulare negru-maronii, citoplasmă roșie, fibre musculare roșii deschise, eritrocite roșii portocalii și țesut conjunctiv colagen verde (vezi Fig. 2-2). Fig. 2-2 Exemplu de ficat colorat cu tricrom Masson-Goldner, femelă MDR2 -/- șoarece, vârsta săptămânii 44

2 Material și metode 26 1. Dezechipare Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III 2 min 2 min Roticlear IV 2 min Roticlear V 2 min 2. Rehidratare 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 3 min 99,9 % EtOH III 2 min 90% EtOH 2 min 80% EtOH 2 min a 3-a colorare hematoxilină conform Weigert 4 min apă curentă de la robinet 10 min acid fuchsin-Ponceau-xylidines 2-4 min 1% acid acetic scurt Acid fosfotungstic portocaliu G 5 min 1% acid acetic scurt Verde deschis 15 min 1% acid acetic 2 min 4. Deshidratare 80% EtOH 30 sec 90% EtOH I 4 min 90% EtOH II 4 min 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 5 min 5. Clear Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 min 5 min 5 min 3 min Tabel 2-3 Protocol Colorare Masson-Goldner tricrom

2 Materiale și metode 28 Hematoxilină-Eozină Masson-Goldner Tri. Stadiul I plus 0 LRMCLRMC depozite de țesut conjunctiv periductal 1-3 edem 1 infiltrat inflamator portal 1 stadiu II plus 5 proliferarea căilor biliare 1 infiltrat inflamator periportal 1 fibroză portal-periportal 1-5 necroză mâncată de molii 1 stadiu III plus 13 atrofie a căilor biliare 1 necroză a cortexului pectoral 1 -3 IV plus 18 rarefacție a căilor biliare 1 ciroză biliară 1 rezultat Tabel 2-4 Scor pentru evaluarea histologică 2.4 Determinarea și evaluarea valorilor serice din sânge 2.4.1 Determinarea activității enzimei 2.4.1.1 Material, dispozitive și software Trusa de test Fluitest LDH-L ANALITIC Biotehnologii (Nr. Cat .: 2222 ) Fluitest GOT/ASAT ANALYTICON Biotechnologies (Cat-Nr.: 1176) Fluitest GPT/ALAT ANALYTICON Biotechnologies (Cat-Cat.: 1186) LDH-Standard 0: NobiCalserum Multi Nobis/HITADO

de/min 2 Material și metode 31 modificări de absorbanță formate pe min. Aceste valori medii au fost reprezentate grafic într-o diagramă de puncte pe ordonată în raport cu activitățile enzimei cunoscute pe standard pe abscisă. Apoi, a fost calculată o linie de potrivire liniară a diagramei punctuale, precum și funcția care o descrie și coeficientul său de determinare. Valoarea măsurată pentru standardul 8 corespundea valorii necompletate. Funcția calculată a fost disponibilă în următoarea formă: După rezolvarea formulei pentru x, perioada 0 min până la x min din fiecare probă de ser a fost utilizată pentru y. Valorile x determinate în acest mod au corespuns activității enzimatice a probei de ser corectate pentru valoarea necompletată și au fost transferate în tabelele Microsoft Excel, evaluate statistic folosind GraphPad Prism și afișate grafic. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0-0,05 Curba standard LDH y = 0,0027x - 0,0213 R² = 0,9987 0 20 40 60 80 100 120 140 Activitatea enzimatică [U/l] Fig. 2-3 Exemplu de curbă standard Evaluarea fotometrică LDH a soluțiilor standard LDH, inclusiv standardele 3-7 2.4.2 Determinarea concentrației TGF-β 2.4.2.1 Material, echipament și software TGF-β 1 peprotech uman recombinant ( Cod produs: 100-21) Dulbecco s PBS (1) PAA Laboratories GmbH (Cod produs: H15-002)

de/min 2 Material și metode 34 Alocarea creșterii extincției pe minut la o concentrație specifică de TGF-β a fost făcută cu ajutorul unei curbe standard (vezi Fig. 2-4). În acest scop, valorile medii ale per standard față de concentrațiile cunoscute de TGF-β 1 per standard au fost reprezentate grafic pe abscisă într-o diagramă de puncte pe ordonată. Au fost calculate linia de regresie liniară a diagramei punctuale, precum și funcția care o descrie și coeficientul său de determinare, valoarea măsurată pentru standardul 8 corespunzând valorii necompletate. Funcția calculată a fost disponibilă în următoarea formă: Curba standard TGF-β 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,0033x + 0,0325 R² = 0,9803 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Concentrație [ng/ml] Fig. 2-4 TGF-β curba standard evaluare fotometrică a soluțiilor standard TGF-β utilizat până la x min din fiecare probă de ser. Valorile x determinate în acest mod au corespuns concentrațiilor TGF-β ale probei de ser corectate pentru valoarea goală și au fost transferate în tabelele Microsoft Excel, evaluate statistic folosind GraphPad Prism și afișate grafic.

2 Material și metode 42 EtBr Glicerol SIGMA (Nr. Cat: E1385-5ML) SIGMA (Nr. Cat: G8773-500ML) peqgold Universal Agarose Peqlab (Nr. Cat: 35-1020) puc19-marker ROTH (Cat- Nr.: X901.1) Taq polimerază 1.000 U Axon Labortechnik (Nr. Cat .: 22466) Tampon de reacție Taq-Polymerase 10 BD MgCL 2 dntp-mix 10 mm per nucleotid Axon Labortechnik (Nr. Cat: 24478) Tris (hidroximetil ) aminometan Mastercycler ep gradient PowerPac TM HC Power Supply Gel ix Imager SIGMA (Cat-No: T87602-3KG) Eppendorf AG, D-Hamburg Bio-Rad Laboratories GmbH, D-Munich Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen Intas Steuer Software de achiziție de imagini Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen 2.6.3.2 Principiul electroforezei PCR și gel PCR este o metodă pentru a putea amplifica selectiv anumite secțiuni ale ADN-ului in vitro. În acest scop, tuburile umplute cu cdna și un amestec de reacție rulează 40 de cicluri într-un dispozitiv, cum ar fi gradientul Mastercycler ep. Fiecare ciclu constă din 3 pași: 1. Denaturare La 95 C legăturile de hidrogen existente între catenele ADN sau primerii sunt rupte astfel încât să rămână doar catenele unice. În timpul inițializării, acest pas este prelungit cu 5 minute, astfel încât să fie deconectate cât mai multe șiruri posibile.