UNIVERSITY CLINIC HAMBURG-EPPENDORF - PDF descărcare gratuită

UNIVERSITY CLINIC HAMBURG-EPPENDORF Institutul de Fiziologie Celulară și Integrativă a Centrului de Medicină Experimentală Prof. Dr. med. Heimo Ehmke Rolul kinazelor WNK în reglarea transportului de electroliți în nefronul distal al șoarecelui knock-out BKβ1 Disertație Pentru a obține diploma de doctor în medicina dentară la Facultatea de Medicină a Universității din Hamburg prezentată de Annelen Dittmer de la Buchholz i.d.n. Hamburg 2013

clinic

Acceptat de Facultatea de Medicină a Universității din Hamburg pe: 13 mai 2014 Publicat cu permisiunea Facultății de Medicină a Universității din Hamburg. Comisia de examinare, președintele: prof. Dr. med. H. Ehmke Examination Board, al doilea recenzor: PD Dr. rer. nat. E. Schwedhelm Examination Board, al treilea recenzor: PD Dr. med. C. Meyer-Schwesinger

Cuprins Cuprins 1. Introducere 7 1.1 Hipertensiune arterială în legătură cu aportul de sodiu. 7 1.2 Sisteme de transport de sodiu și potasiu în rinichi 9 1.3 Sindromul Gordon: Descoperirea rolului kinazelor WNK în reglarea tensiunii arteriale. 17 1.4 Kinazele WNK.18 1.5 Efectele kinazelor WNK asupra echilibrului electrolitic. 20 1.6 Obiectiv și abordare în muncă. 25 2. Material și metode. 27 2.1 Material 27 2.1.1 Echipamente generale de laborator 27 2.1.2 Consumabile. 29 2.1.3 Produse chimice. 30 2.1.4 Enzime.31 2.1.5 Biochimice 32 2.1.6 Kit . 33 2.1.7 Soluții, tampoane.32 2.2 Metode. 36 2.2.1 Dietele de potasiu ale animalelor. 36 2.2.2 Măsuri de protecție pentru izolarea ARN-ului. 37 2.2.3 Disecția rinichiului și izolarea ARN-ului zonei renale. 37 2.2.4 Măsurarea OD a ARN-ului renal izolat 39 2.2.5 Măsurarea agilă a ARN-ului renal izolat 39 2.2.6 Microdisecție 40 2.2.7 Izolarea ARN a tubulilor nefronici. 41 2.2.8 Transcriptaza inversă (RT) . 42 2.2.9 Actin-PCR. 43 4

Cuprins 2.2.10 Electroforeză pe gel de agaroză. 44 2.2.11 PCR în timp real. 44 2.2.12 Statistici. 49 3. Rezultate 51 3.1 Compararea șoarecilor knock-out de tip sălbatic și BKβ1 51 3.1.1 Rezultate ale analizei PCR în timp real a secțiunii cortexului . 51 3.1.2 Rezultate ale analizei PCR în timp real a microdisecției 55 3.2 Rezultatele dietelor de potasiu. 58 3.2.1 Transportorul luminal de sodiu NCC și canalul de sodiu epitelial ENaCβ pe o dietă cu potasiu 58 3.2.2 Canalul apical de potasiu ROMK pe o dietă cu potasiu 61 3.2.3 Kinazele WNK pe o dietă cu potasiu 62 3.2.4 Kinaza SGK1 și proteina GRP58 pe o dietă cu potasiu. 64 3.2.5 Proteina CHIF pe o dietă cu potasiu 66 3.2.6 Transportorul NKCC2 pe o dietă cu potasiu. 67 4. Discuție 68 4.1 Motivarea întrebării 68 4.2 Șoareci de tip sălbatic la o dietă cu potasiu ... 69 4.2.1 Cotransportorul de clorură de sodiu (NCC) 72 4.2.2 Canalul de sodiu epitelial (ENaC). 72 4.2.3 Canalul luminal de potasiu ROMK 73 4.2.4 Comportamentul kinazelor 75 4.2.5 Alte ținte posibile ale aldosteronului 79 4.3 Compararea șoarecilor knock-out de tip sălbatic și BKβ1. 82 4.3.1 Rezultate ale PCR în timp real sub o dietă normală 82 4.3.2 Rezultate ale microdisecției 84 4.4 Șoareci knock-out BKβ1 pe o dietă de potasiu ... 85 5

Cuprins 4.4.1 Dieta cu conținut scăzut de potasiu la șoarecii knock-out BKβ1. 85 4.4.2 Dieta bogată în potasiu la șoarecii knock-out BKβ1 . 88 4.5 Perspectivă. 90 5. Rezumat 93 6. Lista abrevierilor. 94 7. Lista figurilor. 98 8. Lista tabelelor. 101 9. Bibliografie. 102 10. Mulțumiri. 119 11. CV. 120 12. Afidavit . 121 6

Material și metode 2. Material și metode 2.1 Material 2.1.1 Dispozitive generale de laborator Tabelul 1a: Dispozitive generale de laborator utilizate Desemnarea tipului de dispozitiv Balanță de analiză a companiei ISO 9001 Sartorius AG, Göttingen Autoclave 3850 ELC Tuttnauer Systec Ltd., NY, SUA Bioanalizator tip 2100 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA Sursă de alimentare cu electroforeză EPS 600 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg Pipetă de sticlă Baterie de pipete Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co KG, Eberstadt Cameră de electroforeză Omogenizator Polytron Dispozitiv PCR Tiristor controler TR50 Gene Amp PCR System 2400 Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, SUA Perkim Elmer, Norwalk CT, SUA ph-meter ph-meter 320 Mettler-Toledo GmbH, Giessen Photometer Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg Pipettes Pipetman P2, P10, P20, P200, P1000 Gilson, Middleton, WI, SUA 27

Material și metode Tabelul 1b: Echipamente generale de laborator utilizate Denumirea tipului de dispozitiv Companie Balanță de precizie 440-33N Gottl. Kern & Sohn GmbH, Balingen- Frommern Dispozitiv PCR în timp real Light Cycler light goosen light KL 1500 LCD Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Schott AG, Mainz Speed ​​Vac Concentrator 5301 Eppendorf AG, Hamburg Thermoblock TB1 Biometra GmbH, Göttingen Thermomixer 5436 Eppendorf AG, Hamburg Masă cu lumină UV - Biometra GmbH, Göttingen Vortexer MS2 Minishaker Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, SUA Centrifugă Centrifugă 5417C Eppendorf GmbH, Hamburg Centrifugă 5417R Biofug pico Biofug stratos Eppendorf GmbH, Hamburg Heraeus Instruments GmbH, Osterode GmbH Heraeus Osterode 28

Material și metode 2.1.2 Consumabile Tabelul 2: Consumabile utilizate Material Denumirea produsului Companie Pipete de descărcare serică Pipetă 10 ml Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, SUA Sfaturi pentru pipetă Sfaturi sigilate în siguranță: 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl Biozym Biotech Trading GmbH, Viena, Austria Vase cu microreacție 1,5 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 2 ml Sarstedt AG, Nümbrecht Capilare PCR în timp real Tuburi PCR 0,2 ml Tuburi Safe-Lock 0,5 ml pentru Agilent Light Cycler Capillaries (20 µl) Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Tubes Cellstar 50 ml Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster, Austria Tuburi de centrifugare Tuburi 4 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 29