Utilizarea protocolului Tomoauto A pentru protocolul automat de tomografie crio-electronică de mare viteză

rezumat

Vă prezentăm un protocol privind modul de utilizare a tomografiei crio-electronice cu randament ridicat pentru a determina structurile in situ de înaltă rezoluție ale mașinilor moleculare. Protocolul permite procesarea unor cantități mari de date, evită blocajele obișnuite și reduce timpul de nefuncționare a resurselor, permițând utilizatorului să se concentreze pe probleme biologice importante.

Introducere

Sistemele de secreție de tip III (T3SS) sunt determinanți esențiali ai virulenței pentru mulți agenți patogeni Gram negativi. Injectizomul, cunoscut și sub numele de complexul acului, este mașina centrală SST3 necesară pentru translocarea directă a proteinelor efectoare din bacterii în celulele gazdă eucariote 1, 2. Injecizomul constă dintr-un ac extracelular, un corp de bază și un complex citoplasmatic. cunoscut și sub numele de complexul 3. Studiile anterioare au elucidat structurile 3-D ale injectizomilor purificați de Salmonella și Shigella, precum și structurile atomice ale proteinelor bazale majore ale corpului 4, 5. Structuri recente in situ ale injectizomilor de Salmonella, Shigella, și Yersinia au fost dezvăluite de crio-ET 6, 7. Cu toate acestea, complexul citoplasmatic, esențial pentru selectarea ansamblului efector și ac, nu a fost vizualizat în aceste structuri.

Această conductă crio-ET cu randament ridicat a fost utilizată pentru a vizualiza injectizomii intacti în minicelulele S. flexneri. Un total de 1.917 tomograme au fost generate folosind această metodă, dezvăluind rezoluția înaltă a structurii in situ a mașinii intacte, inclusiv platforma de sortare citoplasmatică determinată de sub-tomograma medie de 19. Cu modelarea moleculară a mașinilor de tip sălbatic și a mașinilor mutante, capacitatea noastră de mare viteză conducta oferă o nouă cale de a înțelege structura și funcția injectabilului intact în contextul celular nativ.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Pregătirea Minicell

2. Pregătirea grilei EM

3. Colecție automată serie High Tilt-Series

1. Colecție de planuri de mărire redusă
   1. Deschideți o nouă fereastră Navigator făcând clic pe „Deschidere” în meniul „Navigator” din SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Găsiți celule de rețea care conțin condiții de imagine acceptabile (de exemplu, gheață subțire, fără contaminare, subiect de interes) utilizând ecranul fluorescent cu mărire redusă (

   4. Tratament și reconstrucție automată de serie Tilt de mare viteză folosind Tomoauto

   5. Sub-tomogramă medie

   NOTĂ: Folosim pachetul i3 de 15 (http://www.electrontomography.org/) pentru a procesa experimentele medii de sub tomografie, dar protocolul descris se aplică, în general, pentru majoritatea experimentelor de sub-tomografie sub-tomogramă disponibile. pachete software16to, cu toate acestea protocolul descris se aplică, în general, disponibil pentru majoritatea 16-18 sub-tomogramelor software de mediere.

   Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

   Rezultate reprezentative

   Probele mini-celulare S. flexneri au fost colectate și procesate așa cum se arată sigur figura schematică 1, folosind următoarea conductă detaliată tomoauto sigur cifra 2. Seriile Tilt au fost colectate utilizând SerialEM 10, care permite achiziționarea serialului Tilt-throughput de mare viteză în punctele desemnate de utilizator pe dispozitivele de mărire redusă. (figura 3). Micrografiile au fost colectate folosind modul de fracționare a dozei pe o cameră cu dispozitiv de detectare directă pentru a reduce mișcarea indusă de fascicul 22 (Figura 4). Tomoauto coordonează corecția mișcării luând o colecție de fotografii microscopice care prelucrează doze divizate fiecare cu MOTIONCORR 22 și asamblează rezultatele într-o serie de înclinări care urmează să fie procesate ulterior (Filmul 1).

   
   Figura 1. Prezentare schematică a tomografiei crio-electronice de mare viteză. O suspensie lichidă este înghețată rapid pe o rețea EM și o serie de înclinări sunt colectate de un microscop electronic controlat de computer. Micrografiile obținute sunt procesate automat folosind tomoauto pentru a genera tomografia. Pasul final aici este o minicelula S. flexneri segmentată dintr-o tomografie generată de acest protocol de la Hu și colab. 2.015 15. Vă rugăm să faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

   
   Figura 2. Organigrama procesului tomoauto. O defalcare a fluxului tomoauto arată modul în care datele sunt procesate dintr-o colecție de fotografii microscopice cu doză divizată până la o sub-tomografie finală medie. Simbolurile subprocesului detaliază sarcinile pe care tomoauto le coordonează pentru a procesa intrarea rulând software-ul configurat corespunzător. Simbolurile datelor de ieșire arată în general neutilizate de utilizator, în timp ce documentele și documentele cu mai multe simboluri indică ieșirea manipulată efectiv de către utilizator. În cele din urmă, simbolurile afișate arată unde are loc intervenția utilizatorului în fluxul de lucru. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

   ---