Abordare experimentală pentru examinarea semnalizării Leptinei în corpurile carotide și efectele acesteia asupra controlului
rezumat
Studiul nostru se concentrează pe efectele semnalizării leptinei în corpul carotid (CB) asupra răspunsului de ventilație hipoxic (HVR). Am efectuat experimente de "pierdere a funcției" pentru a măsura efectul leptinei asupra HVR după denervarea CB și a experimentelor de "câștig de funcție" pentru a măsura HVR după supraexprimarea receptorului de leptină în CB.
Abstract
Un hormon produs cu adipocite, leptina, este un stimulent puternic al respirației care poate juca un rol important în apărarea funcției respiratorii în obezitate. Corpurile carotide (CB), un organ cheie al sensibilității hipoxice periferice, exprimă lunga izoformă funcțională a receptorului de leptină (LepR b), dar rolul semnalizării leptinei în controlul respirației nu este pe deplin înțeles. Am examinat răspunsul ventilatorului hipoxic (HVR) (1) la șoareci C57BL/6J înainte și după perfuzia inițială de leptină și după denervarea CB; (2) la LepR b deficient, șoareci obezi db/db la început și după LepR b supraexprimare în CB. La șoarecii C57BL/6J, HVR crescut cu leptină și efectul leptinei asupra HVR au fost abolite prin denervarea CB. La șoareci db/db, expresia lepR b în CB a extins HVR. Prin urmare, concluzionăm că leptina din CB funcționează pentru a spori răspunsurile la hipoxie.
Introducere
Un adipocit produce hormonul leptină care acționează în hipotalamus pentru a suprima consumul de alimente și a crește rata metabolică. Studiile efectuate în laboratorul nostru 1, 2 și de către alți cercetători 3, 4 au arătat că leptina crește răspunsul respirator hipercapnic (HVR), hipoventilația obezității în leptină previne deficiența obezității. Cu toate acestea, majoritatea persoanelor obeze au niveluri ridicate de leptină plasmatică și prezintă rezistență la efectele metabolice și respiratorii ale hormonului 5, 6, 7, 8. Rezistența la leptină este multifactorială, dar permeabilitatea limitată a barierei hematoencefalice (BBB) la leptină joacă un rol important. Propunem ca sub BBB, leptina să acționeze într-un organ cheie al sensibilității hipoxice periferice, corpul carotidian (CB), pentru a apăra respirația la indivizii obezi. CB exprimă lunga izoformă funcțională a receptorului de leptină, LepR b, dar rolul CB în efectele mai respirabile ale leptinei nu a fost elucidat în mod adecvat 9, 10 .
Scopul metodei noastre a fost investigarea efectului semnalizării leptinei în CB asupra HVR. Rațiunea noastră a fost aceea de a (a) efectua scutiri de speculații de la experimentele funcționale la șoareci cu corpuri carotide intacte și corpuri carotide denervate, urmate de măsurători HVR; b) Consolidarea experimentelor funcționale pe șoareci db/db fără LepR b, în care am măsurat HVR la începutul și după exprimarea LepR b exclusiv în CB. Avantajul tehnicilor noastre a fost că am efectuat toate experimentele noastre pe șoareci neîngrădite și neestetizați în timpul somnului și al stării de veghe. Cercetătorii anteriori fie și-au efectuat experimentele sub anestezie 9, fie nu au măsurat efectele leptinei în timpul somnului 10. În plus, studiul nostru este primul care folosește o abordare unică a câștigului funcției cu expresie selectivă LepR-b în CB descrisă mai sus.
Într-un context larg, abordarea noastră poate fi generalizată la alți receptori exprimați în CB și rolul lor în sensibilitatea hipoxică. Anchetatorii pot injecta un ligand unui receptor de interes și pot măsura HVR la debut și după denervarea CB. Ca abordare complementară, un receptor de interes poate fi supraexprimat în măsurătorile CB, iar măsurătorile HVR pot fi efectuate înainte și după supraexprimare cu tehnologia noastră descrisă în acest manuscris.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (MO18M211).
NOTĂ: Pentru a studia efectul leptinei asupra respirației, am infuzat leptina subcutanat în șoareci slabi C57BL/6J printr-o pompă osmotică pentru a crește nivelurile de leptină circulante la cele observate la șoarecii supraponderali.
- Pregătirea pompei osmotice
- Se cântărește pompa goală pentru a verifica greutatea netă a soluției încărcate.
- Adăugați leptină (5 mg/ml) la pompa osmotică (1 L/h timp de 3 zile). Umpleți pompa cu o seringă mică (1 ml). După umplere, închideți pompa folosind tubul de umplere cu 27 de căi, înclinat la capăt, furnizat.
NOTĂ: Seringa și tubul atașat nu trebuie să prezinte bule de aer. - După umplere, cântăriți din nou pompa pentru a verifica greutatea netă a soluției.
- Introduceți pompa de leptină subcutanat în zona interscapulară.
NOTĂ: Dacă doriți să începeți perfuzia imediat, incubați pompa preumplută la 37 ° C la 37 ° C timp de cel puțin 4 până la 6 ore (de preferință peste noapte).
2. Răspunsul ventilator hipoxic (HVR)
3. Denervarea corpului carotidian sau disecția nervului sinusal carotidian (CSND)
NOTĂ: Am efectuat denervarea chirurgicală și chimică combinată la o săptămână distanță, deoarece denervarea chirurgicală singură nu elimină chemoreflexul hipoxic.
4. Exprimarea LepR b în CB cu un vector adenoviral (Ad-LepR b) vs Control (Ad-LacZ)
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Infuzia continuă de leptină a crescut semnificativ HVR la șoarecii slabi C57BL/6J de la 0,23 la 0,31 ml/min/g/FiO2 (P Figura 2) 11. CSND a abolit creșterea HVR indusă de leptină (Figura 2), în timp ce nu s-au observat efecte atenuante ale CSND asupra HVR în grupul de chirurgie simulată după perfuzia cu leptină.
Expresia LepR b în CB a șoarecilor obezi deficienți db/db a indus o creștere semnificativă a HVR de la 0,05 la 0,06 ml/min/g/SpO2 (Figura 3). HVR nu s-a modificat la animalele transfectate în CB cu controlul Ad-LacZ.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Accentul studiului nostru a fost asupra examinării efectelor mai respirabile ale semnalizării leptinei în CB. Au fost dezvoltate mai multe protocoale pentru a evalua rolul leptinei într-un mod mecanicist. În primul rând, contribuția specifică a CB la IHL a fost analizată prin cuantificarea cu atenție a IHL în primele 2 minute de expunere hipoxică. În al doilea rând, relevanța CB pentru reglarea mediată de leptină a controlului respirator a fost examinată prin două abordări complementare. La șoareci slabi de tip sălbatic cu niveluri scăzute de leptină, HVR a fost măsurată la început și după perfuzie continuă de leptină; experimentul a fost repetat după denervarea CB. La șoarecii db/db cu deficit de LepR b, HVR a fost măsurată în CB la începutul și după expresia LepR b.
CSND la șoareci este dificil din punct de vedere tehnic din cauza dimensiunii reduse a animalelor și a CB-urilor lor. Am dezvoltat o abordare constantă de succes, cu o rată de supraviețuire de aproape 100%, în strictă conformitate cu protocolul nostru. Condițiile controlate din protocolul nostru includ mediul termo-neutru, anestezia atent controlată și tehnicile microchirurgicale sterile standard cu vizualizarea nervului glosofaringian ca un control vigilent post-operator cu control al durerii. Experiența noastră arată că denervarea chirurgicală singură nu elimină chemoreflexul hipoxic. Al doilea pas, denervarea chimică, este urmat de un management postoperator atent pentru a îmbunătăți supraviețuirea.
Cea mai inovatoare tehnică a noastră este supraexprimarea selectivă a genelor în zona CB. Această abordare nu a fost încă pusă în aplicare deoarece CB-urile sunt doar de dimensiuni mici și nu sunt exprimați factori specifici care să permită exprimarea unei gene de interes pentru un anumit tip de celulă. De fapt, celulele CB de tip I sunt foarte asemănătoare cu neuronii simpatici sau celulele medularei suprarenale, în timp ce celulele de tip II sunt similare cu astrocitele 20, 21. Am profitat de șoarecii db/db lipsiți de gena LepR b, de capacitatea noastră de a aplica o suspensie adenovirală aproape exclusiv în zona CB și de proprietățile matricei Matrigel, care se solidifică rapid la 37 ° C. Noua noastră abordare poate fi utilizată în viitor pentru a investiga rolul oricărei gene care exprimă eliminări specifice tirozinei hidroxilazei (celule de tip I) sau GFAP-specifice (celule de tip II) în CB cu șoareci de corp întreg devine.
Protocoalele noastre au mai multe limitări. Mai întâi am folosit 3% CO2 pentru a determina IHL, iar întrebarea rămâne dacă porțiunea IHL poate fi de fapt atribuită răspunsului hipercapnic. Pentru a aborda această limitare, cercetătorii pot măsura simultan răspunsurile la compensarea de 3% CO2 în gazul hiperoxic, ceea ce ar opri CB. În al doilea rând, HVR nu poate fi complet eliminat de CSND 22. Acest fenomen poate fi atribuit neuroplasticității, care este deosebit de pronunțată la șoareci. Prin urmare, este important să studiați HVR cât mai curând posibil după CSND și să utilizați întotdeauna controlul chirurgiei simulate. În al treilea rând, abordarea noastră de exprimare a genei CB nu avea tip de celulă și specificitatea organelor. Tehnicile moleculare, cu utilizarea viitoare a promotorilor mai selectivi, pot ajuta la contracararea acestei limitări.
În concluzie, în ciuda limitărilor descrise mai sus, protocoalele noastre pot investiga rolul anumitor gene CB în răspunsurile fiziologice la hipoxie.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Dezvăluiri
Autorii nu au interese sau dezvăluiri contradictorii.