Apariția și detectarea citrininei în alimentele de origine vegetală - PDF gratuit
De la Centrul de Științe Weihenstephan pentru Nutriție, Utilizarea Terenului și Mediu al Universității Tehnice din München, Catedra de Igienă Animală Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. Johann Bauer Prezentat de Institutul pentru igienă și tehnologia alimentelor de origine animală Catedra pentru igienă și tehnologie a laptelui Univ.- Prof. Dr. Erwin Märtlbauer Facultatea veterinară a Universității Ludwig Maximilians din München Apariția și detectarea citrininei în alimentele de origine vegetală Disertație inaugurală pentru obținerea doctoratului veterinar al facultății veterinare a Universității Ludwig Maximilians München de Claudia Barbara Schneider din München München 2007
Tipărit cu permisiunea Facultății de Medicină Veterinară a Universității Ludwig-Maximilians München Decan: Vorbitor: Co-arbitru: Prof. univ. Dr. E. P. Märtlbauer Prof. Dr. Märtlbauer iun. Prof. Dr. Ziua absolvirii Deeg: 9 februarie 2007
Soțul meu și cele două fiice ale mele
Pagina I Cuprins O Introducere. 1 B literatură. 3 1 Proprietățile fizice și chimice ale citrininei. 3 2 Ciuperci producătoare de citrinină. 5 3 Apariția citrininei. 7 4 Toxicocinetica. 9 5 Proprietățile biologice ale citrininei. 10 5.1 Efecte asupra microorganismelor. 10 5.2 Efecte asupra macroorganismelor și sistemelor celulare. 10 5.2.1 Citotoxicitate. 11 5.2.2 Nefrotoxicitate. 12 5.2.3 Genotoxicitate. 15 5.2.4 Carcinogenitate. 16 5.2.5 Efecte embriotoxice și teratogene. 17 5.2.6 Efecte combinate cu alte micotoxine. 17 5.3 Proprietăți farmacologice. 18 6 Metodă de detectare a citrininei. 19 C Material și metode. 20 1 material. 20 1.1 Material de probă. 20 1.2 Consumabile. 21 1.3 Consumabile. 21 1.4 Produse chimice. 22 2 metode. 22 2.1 Dezvoltarea metodei pentru determinarea citrininei în cereale. 23 2.1.1 Teste preliminare pentru extracție. 23 2.1.2 Teste preliminare pentru purificare. 24 2.1.2.1 Separarea lichid-lichid. 24 2.1.2.2 Purificare prin extracție în fază solidă. 30 2.1.2.3 Purificare prin cromatografie cu imunoaffinitate. 33 2.2 Dezvoltarea metodelor de determinare a citrininei în sucurile de fructe și legume. 34
Pagina II 2.3 Studii orientative privind stabilitatea citrininei în sucurile de fructe 38 2.4 Determinarea citrininei în alimentele asiatice. 38 2.5 Validarea metodelor. 39 2.6 Determinarea spectrometrică de masă a citrininei. 41 2.6.1 Analiza LC-MS a cerealelor. 41 2.6.2 Analiza LC-MS/MS a sucurilor de fructe și legume, precum și a alimentelor asiatice. 42 2.7 Examinarea probelor comerciale. 43 D rezultate. 45 1 Detectarea și determinarea citrininei utilizând ESI-MS sau MS/MS. 45 2 experimente preliminare pentru determinarea citrininei în matrici organice. 48 2.1 Cereale. 48 2.1.1 Extragerea. 48 2.1.2 Purificare. 49 2.1.2.1 Separarea lichid-lichid. 49 2.1.2.2 Purificare prin extracție în fază solidă. 52 2.1.2.3 Purificare utilizând coloane de imunoaffinitate. 54 2.2 Sucuri de fructe și legume. 55 2.2.1 Rezultatele testelor preliminare. 55 2.2.2 Studii preliminare privind stabilitatea citrininei în sucul de mere. 57 2.3 Validarea metodei. 58 3 Apariția citrininei în alimente. 61 3.1 Cereale. 61 3.2 Sucuri de fructe și legume. 62 3.3 Alimentele asiatice. 62 E discuție. 63 F rezumat. 68 G Rezumat. 69 H Bibliografie. 70
Pagina III Lista figurilor: Figura 1: Formula structurală a citrininei, A) forma p-chinonei și B) forma o-chinonei. 3 Figura 2: Cromatogramele LC-MS (m/z 251) ale unei soluții standard (5 ng/ml, de mai sus) și o probă de făină de porumb care conține citrinină (4,4 µg/kg, mai jos). 46 Figura 3: Spectrul de masă al citrininei (ESI +, tensiunea conului 30 V). 46 Figura 4: Cromatograme LC-MS/MS (m/z 249/175) ale unei soluții standard (1 ng/ml, mai sus) și o probă de suc de mere contaminată artificial cu citrinină (c: 0,1 ng/ml, mai jos). 47 Figura 5: Comportamentul degradării citrininei în sucul de mere la temperatura camerei. 58
Pagina VI Lista abrevierilor aw valoarea activității apei BEN Balcan Nefropatie endemică Celule BHK21 Celule renale Babyhamster Celule CHO-K1 Celule ovare de hamster chinezesc ADN Acid dezoxiribonucleic (DNS: Acid deoxaribonucleic) EIA Imunoanaliză enzimatică (Imunoanaliză enzimatică) g Accelerația pământului (1g = 9,81 m/s 2) g grame de acid clorhidric HCl celule Hela celule carcinom de col uterin celule celule HEK293 celule renale embrionare umane celule HL-60 celule de leucemie promielocitară umană HPLC cromatografie lichidă de înaltă performanță HPRT hipoxantină-guanină-fosforibosil-transferază celule HTC celule de țesut hepatom cromatografie imunoaffinitate Agenția Internațională IARC pentru Cercetarea Cancerului im intramuscular i.p. intraperitoneal i.v. intravenos kg kilograme greutate corporală LC-MS lichid cromatografie-spectrometrie de masă LC-MS/MS lichid cromatografie-tandem spectrometrie de masă LD letaldoză LLC-PK1 Porcine linie de celule renale MDBK celule MDBK Madin Darby bovine rinichi celule MeOH metanol min minute ml mililitri mm milimolar MPN Nefropatie porcină micotoxică m-rns acid ribonucleic mesager m/z masă/sarcină n număr de NADH nicotinamidă adenină dinucleotidă N 2 azot nm nanomolar ng nanogramă nn soluție salină tamponată cu fosfat PBS nedetectabilă p.o. per os
Pagina VII ppb părți pe miliard ppm părți pe milion RNS acid ribonucleic r-rns acid ribonucleic ribosomal RP Fază inversă RNS acid ribonucleic s.c. test SCE subcutanat test de schimb de cromatide surori TBME terțiar butil metil eter TLC cromatografie în strat subțire Test UDS sinteză ADN neprogramată (sinteză de reparare a ADN) testare celule V79 fibroblaste pulmonare ale hamsterilor chinezi masculini Organizația Mondială a Sănătății OMS micrograme µm micromolar
Literatura pag. 6 Tabelul 2: Genul Aspergillus Penicilium Monascus ciuperci producătoare de citrinină (Cole și Cox, 1981; Betina, 1989, Roth și colab., 1990; Frank, 1992; Blanc și colab., 1995b, Wang și colab., 2005) Specie A. candidus A. flavipes A. niveus A. terreus P. canescens P. citroviridae P. citrinum P. claviforme P. expansum P. fellutanum P. implicatum P. janthinellum P. jenseni P. lividum P. palitans P. purpurrescens P. . roqueforti P. spinolosum P. velutinum P. verrucosum M. floridanus M. lunisporas M. pallens M. pilosus M. purpureus M. ruber M. sangiuneus
Literatură pagina 19 6 Metode de detectare a citrininei În comparație cu alte micotoxine, există doar puține date despre apariția citrininei în alimente. Acest lucru se datorează parțial particularităților sale analitice, prin care instabilitatea toxinei în timpul pregătirii probei și ratele de recuperare puternic fluctuante cauzate de aceasta (Wilson, 1994), precum și rezistența pronunțată la detectarea cromatografică se pot dovedi a fi problematice (Dick, 1988). Până în prezent, detectarea citrininei a fost efectuată în principal folosind cromatografie în strat subțire (TLC) (Blanc și colab., 1995a, b, Martins și colab., 2002, Gimeno, 1984), cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu UV (Phillips și colab., 1980) sau detectarea fluorescenței Lepom, 1986, Reinhard și Zimmerli, 1999b, Schneweis și colab., 2001) și cromatografia gazoasă (GC) (Shu & Lin, 2002). și imunoanalize enzimatice (EIA) (Abramson și colab., 1996, 1999, Dietrich și colab., 1998, 1999, Vrabcheva și colab., 2000, Schmid, 2002) sunt utilizate.
Material și metode pagina 20 C Material și metode 1 Material 1.1 Material de probă În această lucrare au fost examinate în principal cereale și produse din cereale, precum și sucuri de fructe și legume. În plus, au fost analizate alimentele asiatice individuale. Probele au fost obținute de la comercianții cu amănuntul. Cereale Un total de 380 de probe au fost analizate pentru prezența citrininei. Dintre acestea, 279 erau produse din cereale/cereale și 69 erau produse din porumb/porumb. În plus, au fost examinate 19 produse de hrișcă/hrișcă și 13 probe de orez. Sucuri de fructe și legume Din cele 98 de sucuri analizate, 34 au fost mere, 27 portocale, 7 struguri, 8 ananas, 4 pere, 7 banane, 3 piersici, 4 multivitamine, 3 roșii și 1 suc de mandarină. Mâncare asiatică 2 probe de vin de sake și 2 sosuri hoi-sin, precum și o pastă asiatică de condimente au fost examinate pentru prezența citrininei. S-a utilizat material de probă inofensiv micologic pentru a dezvolta și valida metodele de detectare. Contaminarea artificială a materialului de probă a avut loc cu soluții standard de citrinină.