Capacitatea de diferențiere a protocolului celulelor progenitoare adipoză perivasculară aortică umană (Traducere

rezumat

Scopul acestui protocol este de a testa capacitatea celulelor progenitoare derivate din țesutul adipos perivascular uman de a se diferenția în mai multe linii ale celulei. Diferențierea a fost comparată cu celulele stem mezenchimale de măduva osoasă umană, despre care se știe că se diferențiază în linii de celule adipocite, osteocite și cartilaginoase.

Abstract

Introducere

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Utilizarea țesuturilor umane în acest studiu a fost evaluată și aprobată de Consiliul de revizuire instituțională al Centrului Medical din Maine, iar tot personalul a primit pregătire adecvată înainte de experimentări.

2. Protocolul 1: Cultura celulelor PVAT umane din ruptura vasculară stromală

Notă: PVAT este rezecat de la locul anastomozei grefei la aorta ascendentă la pacientul anesteziat cu angioplastie de bypass coronarian. PVAT aortic este plasat într-un conic de 15 ml cu 10 ml DMEM-F12 cu glucoză răcită cu gheață și transferat în laborator din sala de operație în decurs de 2 ore de la rezecție. PVAT aortic este țesut aruncat în timpul procedurilor de bypass și este considerat ca cercetare subiecți non-umani de către departamentul de audit intern al Maine Medical Center.

500 mg bucată de PVAT uman (aproximativ 3 x 1 x 0,5 cm 3). Transferați PVAT uman proaspăt din DMEM într-un tub conic de 50 ml conținând 25 ml soluție de antibiotice. Se incubează cu rockigen timp de 20 de minute la 4 ° C. În timp ce PVAT este în soluție de antibiotice, dezghețați o alicotă a tamponului de disociere la 37 ° C. Se adaugă 5 ml tampon de disociere 50 uL soluție antibiotic/antifungic 100 X și se sterilizează cu un filtru de seringă de 0,22 um. De asemenea, adaug 1 ml de soluție de gelatină dintr-o placă cu 24 de godeuri. Într-o hota cu flux laminar, utilizați o pensetă și o foarfecă sterile pentru a transfera PVAT din soluția de antibiotice într-o cutie Petri sterilă. Adăugați 1 ml de tampon de disociere preîncălzit la țesut și tocați mărunt întregul țesut într-o suspensie (fără o bucată mai mare de

Adăugați 1 mL mediu de cultură proaspăt și distribuiți 500 µL, 2 godeuri dintr-o placă cu 24 de godeuri, fiecare cu 500 µL mediu de creștere și 25 ng FGF2.

De asemenea, celulele obținute din PVAT uman continuă să se extindă, așa cum sa indicat în pasul anterior. Fiecare pasaj nu trebuie să fie mai mare decât o împărțire 1: 2. Celulele sunt trecute de 5-7 ori înainte de a fi alocate pentru teste de diferențiere.

3. Protocolul 2: Cultura colonii de măduvă osoasă umană MSC

Notă: MSC de măduvă osoasă umană izolat conform descrierii 8 și stocat ca stocuri de trecere timpurie în medii de îngheț înghețate (70% FBS, 20% DMEM bazal și 10% DMSO)

100.000 celule/ml în N2 lichid.

Dezghețați rapid un flacon de măduvă osoasă MSC din lichidul N2 într-o baie de apă și placă de 37 ° C într-un puț al unei plăci de cultură cu 6 godeuri cu 3 ml mediu de creștere MSC și incubați peste noapte la 37 ° C și 5% CO2.
A doua zi, aspirați mediul de cultură MSC și spălați celulele de 3 ori în 2 ml de HBSS. La confluență 100%, aspirați medii de creștere și spălați celulele de 3 ori în 2 ml de HBSS. Se adaugă 500 pl/godeu de soluție de detașare a celulei și se incubează la 37 ° C și 5% CO2 timp de 5 minute. Atingeți placa pentru a vă asigura că toate celulele sunt deplasate și distribuiți conținutul uniform în 2 godeuri într-o placă cu 6 godeuri care conține 2 ml de mediu de creștere MSC.
Extindeți în CSM derivat din măduva osoasă umană și PVAT în paralel pentru aproximativ 5 - 7 pasaje sau până când s-au atins cantități suficiente pentru testare.

4. Protocolul 3: Placă și induceți linii adipogene, osteogene și condrogenice

5. Protocolul nr. 4: Cultura liniilor adipogene, osteogene și condrogenice timp de 14 zile

6. Protocolul nr. 5: colorarea stării adipogene cu roșu uleios O

7. Protocolul 6: colorarea stării osteogene cu roșu de alizarină

Scoateți tot lichidul din fiecare godeu. Adăugați volume adecvate de soluție de colorare roșie de alizarină 2% în fiecare godeu (1,5 ml per godeu pentru o placă cu 12 godeuri) și înclinați ușor placa dintr-o parte în alta până când soluția acoperă complet fundul godeului.
Se incubează 15 minute la temperatura camerei. Scoateți roșu alizarina din fântână. Clătiți fiecare godeu de patru ori cu H2O distilat, având grijă să nu deplasați ușor cristalele de calciu. lasă să se usuce.

8. Protocolul 7: Colorarea stării condrogenice cu tricromul Masson

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Izolarea fracției vasculare a celulelor stromale din PVAT uman

Figura 1A prezintă o reprezentare schematică a regiunii anatomice care a fost determinată supra-aorta ascendentă PVAT. Grupurile de pacienți în operația de bypass coronarian aceste mostre derivate din cele 6 au fost descrise anterior - Figura 1b prezintă un exemplu de PVAT uman obținut după operație. ilustrația 1 prezintă o secțiune reprezentativă din țesătură PVAT colorată cu colorare Masson Trichrome. ilustrația 1 este o micrografie contractuală de fază care prezintă o populație de celule stromale derivate din PVAT în timpul fazei de expansiune înainte de diferențiere. Celulele pot fi extinse și înghețate pentru utilizare ulterioară. Celulele sunt de obicei la o densitate de 2,5 x 105 celule/ml într-un mediu format din 70% FBS congelat, 20% bazal (fără antibiotice) DMEM-F12 și 10% DMSO într-o cameră de izopropanol. 80 ° C timp de 24 de ore și mutat în faza lichidă a congelatorului N2 lichid pentru depozitare pe termen lung.

Diferențierea adipogenă

MSC paralel cu măduva osoasă umană (Fig. 2AB.) și celulele progenitoare derivate din PVAT (Figura 2D.) au fost efectuate studii. Panourile din stânga din Figura 2 arată starea indusă în care nu este evidentă acumularea de lipide. Plăcile corecte arată celulele prin diferențierea adipocitelor și colorarea lipidelor neutre cu roșu uleios O. În timp ce gradul de diferențiere în valva aortică umană este mai robust în celulele derivate din PVAT, ambele surse au prezentat celulei umane capacitatea de a diferenția în direcția liniei adipogene.

Diferențierea osteogenică

Protocolul de diferențiere osteogenică a fost aplicat la MSC derivat din măduva osoasă umană (Fig. 3A-C.) și celule recoltate de PVAT (Figura 3D- F) este folosit. Celule neinduse (Fig. 3AD.) nu patați roșu cu alizarină. Conform protocolului de diferențiere osteogenică, MSC uman a dezvoltat noduli calcificați care au fost colorați în roșu cu alizarină (Fig. 3b- C), în timp ce celulele derivate din PVAT aortice umane nu (Figura 3E-F.). Aceste date sugerează că prepararea noastră de celule din ruptura vasculară stromală a PVAT umană nu are numeroși strămoși cu capacitatea de a suferi osteogeneza. În funcție de studiu și de durata diferențierii, se recomandă urmărirea petelor standard cu detectarea markerilor moleculari care definesc implicarea liniei de formare osoasă (de exemplu, RUNX2, Osterix, fosfatază alcalină) sau osteoblaste (osteopontin, osteocalcin, fosfatază alcalină, BAP1).

Diferențierea condrogenă

Celulele din ambele măduve osoase umane MSC (Fig. 4A) PVAT derivat și uman (Figura 4b) prezintă trăsături caracteristice diferențierii condrogenice, cu acumulare abundentă de colagen în micromasă. Micromasele formate din MSC din măduva osoasă umană și celule derivate din PVAT aortice au prezentat, de asemenea, acumulări abundente de glicozaminoglicanii (albastru), după cum se indică prin colorarea albastru alcian (Figura 4-D., respectiv). Din punct de vedere morfologic, structurile au fost similare cu golurile cu așezarea în cavități create prin depunerea de colagen (Figura 4, Săgeți) celulele din jur. În funcție de studiu și de evoluția timpului de diferențiere, este utilă detectarea anumitor markeri condrogenici (aggrecan, colagen tip II, osteonectină, Sox9).

Figura 1: Caracteristicile morfologice ale PVAT uman. (A.) Reprezentarea în desene animate a aortei umane (roșu) cu PVAT înconjurător (galben). Săgeata arată aorta ascendentă. (B.) o bucată de 480 mg de valvă aortică umană PVAT de la un pacient CABG în DMEM înainte de disociere. (C.) Pata de tricrom PVAT uman încorporată în parafină fixată în formalină a lui Masson (maro închis/negru = nuclei, albastru/violet = țesut conjunctiv, roz = citoplasmă; rețineți că globulele roșii apar roșu-roz. (D.) Imagine reprezentativă a celulelor stromale PVAT explantate în 7 zile în cultură. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Figura 2: diferențierea adipogenă. (A.) Microscopia în fază a măduvei osoase umane MSC în stare neindusă nu prezintă dovezi de diferențiere. (B.) Microscopia în fază a măduvei osoase umane MSC în starea adipogenă indusă arată o oarecare diferențiere și imobilizare a lipidelor neutre, colorate cu roșu ulei O după 14 zile. (C.) Microscopia în fază a celulelor derivate din PVAT aortice umane în starea adipogenică neindusă nu prezintă dovezi de diferențiere. (D.) Microscopia în fază a celulelor derivate din PVAT aortice umane în starea adipogenă indusă arată o diferențiere robustă și imobilizarea lipidelor neutre, colorate cu roșu ulei O după 14 zile. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Figura 4: Diferențierea condrogenă. (A, B) Microscopia cu lumină a unei secțiuni a micromasei formată din măduva osoasă umană MSC (A) sau celule progenitoare PVAT ale valvei aortice umane (B) în starea condrogenă indusă după 14 zile în cultură și apoi colorate cu tricrom Masson, sugerând depunerea semnificativă de colagen (albastru) și sugerează diferențierea cu succes către o descendență condrogenă. (C, D) Microscopie cu lumină a unei secțiuni a Micromasei formată din măduva osoasă umană MSC (C) sau celule precursoare PVAT ale valvei aortice umane (D) în starea condrogenă indusă după 14 zile în cultură și apoi colorate în albastru cu Alcian, sugerând depunerea de proteoglicani acizi (de ex. B. glicozaminoglicanii) decât se găsesc de obicei în cartilaj. Contraindicație, roșu nuclear rapid; Săgeți, structuri asemănătoare unui gol. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Celulele stem ale țesutului adipos au devenit un focus pentru aplicațiile de medicină regenerativă, datorită accesului ușor și a numărului mare de celule care pot fi derivate din țesutul adipos 12, 13. Celulele vasculare, celulele inflamatorii, fibroblastele, preadipocitele și celulele stem ale țesutului adipos se găsesc în porțiunea vasculară a celulelor stromale a țesutului adipos. Există diferențe în populația de celule stem pe baza localizării anatomice a depozitului adipos și a proprietăților adipocitelor 14. Cel mai important, celulele stem derivate din țesutul adipos par a fi capabile să se diferențieze nu numai în linii mezenchimale 15, ci și potențialul de a-și asuma destinația neuronală 16, 17 și epidermală.

Numeroase studii s-au concentrat asupra celulelor stem/progenitoare derivate din țesutul adipos alb subcutanat uman, dar puține studii au abordat proprietățile populațiilor progenitoare ale PVAT. Studii recente au izolat celulele progenitoare adipocitare din vasele mezenterice din jurul PVAT sau aorta toracică de șobolan. În timp ce aceste populații CD34 +/CD140a + se diferențiază în adipocite, abilitatea de a desena alte linii nu a fost testată 19 .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii nu au dezvăluit nimic.

Mulțumiri

Recunoaștem sprijinul cercetării de navigație de la Maine Medical Center pentru asistență în obținerea țesutului clinic și a nucleului de histopatologie și histomorfometrie (susținut de 1P20GM121301, L. Liaw PI) de la Institutul de cercetare pentru tăiere și colorare din Centrul Medical Maine. Această lucrare a fost susținută de NIH Grant R01 HL141149 (L. Liaw).