Caracterizarea mecanismelor moleculare ale protocolului in vivo de cataractă indusă de UVR (tradus în

rezumat

Cataracta este principala cauză de orbire din lume. Radiațiile ultraviolete de la soare (UV) sunt principalul factor de risc pentru dezvoltarea cataractei. A fost dezvoltat un model animal de cataractă indusă de UVR-B. În acest articol descriem metode pentru studierea dezvoltării cataractei: expunerea la radiații UV, RT-PCR cantitativă și imunohistochimie.

Abstract

Cataracta este principala cauză de orbire din lume. Organizația Mondială a Sănătății definește cataracta ca o opacificare a cristalinului ochiului care împiedică transmiterea luminii. Cataracta este o boală multifactorială care include diabetul, fumatul, radiațiile ultraviolete (UVR), alcoolul, radiațiile ionizante, steroizii și hipertensiunea. Există dovezi experimentale puternice 2-4 și epidemiologice 5.6 că UVR provoacă cataractă. Am dezvoltat un model animal pentru cataracta indusă de UVR B atât la animalele anesteziate 7, cât și la animalele neanesteziate 8.

Singurul tratament pentru chirurgia cataractei este, dar acest tratament nu este disponibil pentru toată lumea. S-a estimat că întârzierea apariției cataractei timp de 10 ani ar putea reduce necesitatea unei intervenții chirurgicale a cataractei cu 50% 9. Pentru a întârzia apariția cataractei, este necesar să înțelegem mecanismele de formare a cataractei și să folosim strategii eficiente de prevenire. Dintre metodele de dezvoltare a cataractei, apoptoza joacă un rol important în inducerea cataractei la oameni și animale 10. Ne concentrăm recent pe apoptoza din cristalin ca mecanism de dezvoltare a cataractei 8,11,12. Se așteaptă ca o mai bună înțelegere a efectului radiației UV asupra căii apoptotice să ofere oportunități pentru descoperirea de noi medicamente pentru prevenirea cataractei.

În acest articol vom descrie modul în care cataracta poate fi indusă experimental prin expunerea in vivo la UVR-B. RT-PCR și imunohistochimie prezentate ca instrumente pentru studierea mecanismelor moleculare ale cataractei induse de UVR-B.

Protocol

A. Expunerea la radiații ultraviolete

  1. Cu 15 minute înainte de expunere, anesteziați un șobolan Sprague-Dawley de sex feminin cu un amestec de 90 mg/kg ketalar (ketamină) și 10 mg/kg rompun (xilazină) prin injecție intraperitoneală.
  2. Așezați animalul într-un suport pentru șobolan și trageți ligamentele până la imobilizarea șobolanului fără a stoarce o tulpină 13.
  3. Instilați midriacil (tropicamidă), 10 mg/ml, la ambii ochi ai șobolanului pentru a induce midriaza.
  4. Așezați animalul astfel încât un ochi să fie poziționat împotriva unui fascicul îngust de UVR la 300 nm 10 nm 14 cu lățimea maximă la jumătate maximă și protejați ochiul contralateral cu folie neagră.
  5. Setați șobolanul unilateral la doza sub prag de 1 kJ/m 2 UVR-B la 300 nm timp de 15 minute 15.

4. Colorarea imunohistochimică

20 min).

  • Păstrați secțiunile în întuneric în așteptarea analizei.
  • Toate secțiunile de control sunt procesate în absența anticorpilor primari.
  • Căutați rezultate la microscopul de fluorescență în câteva ore.
  • Numărați nucleele celulelor epiteliale de pe o parte a arcului nuclear pe cealaltă parte a arcului nuclear al fiecărei lentile. Aplicați filtrul albastru standard tuturor nucleelor ​​epiteliale ale lentilelor în albastru și un filtru standard care se potrivește cu emisia anticorpului secundar pentru a vedea nucleele pozitive caspază-3 în verde.
  • Înregistrați numărul tuturor nucleilor epiteliali ai lentilelor și numărul de nuclei pozitivi. Numărați celulele de trei ori pentru fiecare secțiune.

    • Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    Diferitele surse de variație ale măsurătorilor au fost estimate utilizând o analiză a varianței și s-a constatat că luând în considerare trei măsurători pe animal, varianța pentru măsurători a fost de ordinul a 15% față de animal. Astfel, luând în considerare întreaga analiză a lentilelor, nu este posibilă creșterea preciziei. Testele ortogonale au clarificat o diferență semnificativă statistic pentru mesajul caspase-3 între 120 de ore de latență versus intervale de latență mai scurte.

    Expunerea UVR in vivo induce expresia caspazei-3.

    mecanismelor
    ilustrația 1. Schema fluxului de iradiere cu radiații ultraviolete.

    vivo
    Figura 2. Dezvoltarea expresiei mRNA caspazei-3 (CASP3) în lentila oculară după expunerea in vivo de 1 kJ/m2 la 300 nm UVR. Barele de eroare sunt intervale de încredere de 95% pentru raportul mediu CASP3 mARN/18s rARN între lentila expusă și lentila contralaterală neexpusă. Mijloacele, deasupra și dedesubtul liniei negre în 1 rel. Fiecare unitate reprezintă reglarea în sus și în jos a genei CASP3.

    vivo
    Figura 3. Expresia Caspase-3 (A) într-o lentilă expusă, la 24 de ore după expunere și (B) într-o lentilă neexpusă. Săgețile arată celule marcate.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Discuţie

    Această lucrare descrie metode care permit studiul evenimentelor moleculare care au provocat cataracta în timpul UVR-B.

    Observând că majoritatea informațiilor pentru cataracta indusă de UVR in vivo au fost derivate din experimente pe șobolani albini Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, am decis să includem șobolanul albin Sprague-Dawley în studiu curent de utilizat. Vârsta șobolanilor era de șase săptămâni. Sexul a fost ales pentru a fi de sex feminin deoarece, spre deosebire de masculi, femelele au mai puțină urină alergenică. În plus, nu există nicio diferență de gen în severitatea cataractei induse de UVR 20.

    Toate animalele au fost ținute și tratate în conformitate cu declarația ARVO pentru utilizarea animalelor în cercetarea oftalmică și vizuală. Aprobarea etică a fost obținută de la Comitetul de etică al experimentelor pe animale din Uppsala, numărul protocolului C 29/10. Șobolanii sunt cumpărați de la un crescător comercial (Taconic, Danemarca).

    Cortul "> S-a ales o sursă UVR cu bandă îngustă, astfel încât UVR să fie bine definită spectral. Sensibilitatea maximă a lentilei UVR-B de șobolan este în jur de 300 nm. Doza 1 kJ/m 2 a fost aleasă în jurul dozei de prag 15. Timpul de expunere de 15 minute a fost ales pentru a induce deteriorarea maximă a lentilei 21. Doza de expunere la radiații UV-B și post-expunere poate varia în funcție de designul experimental.

    Ochiul de organ pereche are avantajul său sub formă de statistici și etică în utilizarea animalelor în cercetare. Expunerea unilaterală a ochiului poate folosi o parte ca expusă și cealaltă parte ca un control la un animal, astfel încât reduce numărul de animale la jumătate comparativ cu organul nepereche.

    În acest protocol am folosit anestezia ca metodă de imobilizare a animalelor. Dar, de asemenea, o altă alternativă poate fi folosită pentru eliminarea șobolanilor 13, pe care am dezvoltat-o ​​în laboratorul nostru, pentru a imobiliza animalele neanesteziate. Șobolanii trebuie să fie condiționați de dispozitivul de blocare a șobolanilor înainte de expunerea la UV. Acest dispozitiv permite, de asemenea, expuneri repetate controlate atunci când anestezia nu este recomandată din cauza efectelor sale secundare. Aici avem dispozitivul de blocare a șobolanilor ca poziționare și suport pentru animalele anesteziate.

    Suportul pentru șobolan este fabricat din lemn și se află în diferite poziții în laboratorul nostru. Ne curățăm dispozitivul de reținere înainte ca fiecare animal să fie așezat pe el. Blocurile de lemn, jgheaburile și adăposturile din lemn sunt folosite ca îmbogățiri în cuștile pentru șobolani. Această îmbogățire este aprobată de Comitetul de etică al experimentelor animale din Uppsala și de Federația Asociațiilor Europene de Științe Animale de Laborator (FELASA).

    Obiectivul trebuie pregătit în BSS într-un timp scurt (5-10 min). Această limitare permite obiectivului să rămână clar și transparent.

    Timpul de 30 de minute pentru ghidarea lentilei în tamponul de liza RA1 este suficient pentru a perturba capsula lentilei și cortexul. Miezul lentilei rămâne dur în 30 de minute. Nucleul lentilei sau zona fără organite este considerat a fi o parte inactivă a lentilei ca factor de transcripție. Prin urmare, miezul va fi îndepărtat din probă pentru a crește raportul semnal-zgomot-expresie mARN.

    Primerul specific ADN utilizat pentru controlul purității ARN (fără ADN) a fost ales la întâmplare pentru a avea primeri p53. Orice secvență de ADN codificată în mod obișnuit, în special genomul animalului, ar putea fi aleasă. Ambele obiective au fost analizate cu PCR pentru 10 animale pe interval de post-expunere și pentru fiecare obiectiv, conținutul de ARN caspază-3 a fost determinat în trei măsurători independente.

    RT-PCR permite măsurarea mARN-ului de interes. Transcriptaza inversă convertește ARNm în ADN complementar, care este apoi amplificat prin PCR. Măsurătorile au fost cuantificate utilizând curba standard prin amplificarea probelor diluate în serie de ADNc obținut din intERest. Avantajele utilizării unei curbe standard sunt că curba standard oferă o modalitate fiabilă de a calcula incertitudinea de concentrație și că curba standard oferă măsurători cantitative ale ARNm de interes. Alternativ, conținutul relativ al ARNm de interes ar putea fi estimat prin compararea directă a numărului de cicluri necesare pentru a obține un semnal fluorescent standardizat utilizând procedura CT. Principalul dezavantaj al curbei de calibrare este că necesită mai mult decât metoda Ct a produselor genomice.

    Imunohistochimia a fost utilizată pentru a studia distribuția spațială a caspazei-3 active în celulele epiteliale ale lentilelor.

    Ochii au fost imediat înghețați la -70 ° C pentru a opri orice biochimie în curs. Ochii au fost apoi depozitați la aceeași temperatură pentru conservare.

    Imunohistochimia este asociată cu două probleme generale, specificitatea anticorpului primar și legarea nespecifică a anticorpului. Anticorpul trebuie obținut dintr-o sursă bine controlată, garantând astfel specificitatea. Dacă este posibil, epitopul care conține țesut ar trebui să fie colorat ca un control pozitiv. Pentru a elimina colorarea nespecifică Dacă este posibil, epitopul trebuie blocat înainte de colorarea cu anticorpul specific, control negativ. Mai mult, colorarea nespecifică poate fi minimizată prin concentrația optimă de anticorpi și timpul de reacție. Prin colorarea atât a țesutului expus la UVR, cât și a țesutului care nu este expus la UVR, este posibil să se producă epitopul UVR indus, aici caspaza-3. Pentru a facilita numărarea celulelor care prezintă semnalul caspapse-3, imaginea microscopului de fluorescență a fost înregistrată digital. Pentru a minimiza variația zgomotului de fundal, avem setări fixe pentru toate imaginile microscopice.

    Intensitatea semnalului de fluorescență de fundal variază pe o scară continuă. Prin urmare, trebuie stabilit un prag pentru colorarea semnificativă. Cu toate acestea, fluorescența medie poate varia spațial în cadrul secțiunii observate, ceea ce face dificilă utilizarea unui prag absolut pentru o contaminare semnificativă. Prin urmare, de obicei judecata colorării specifice se bazează pe un observator experimentat, iar rezultatul absolut colorarea specifică depinde de opinia observatorului experimentat, dar va fi consecvent pentru acest observator. Din acest motiv, a fost folosit doar un observator experimentat. Pentru a îmbunătăți ceea ce este cauzat de expunerea variabilă experimentală la radiații UV în comparație cu zgomotul, fotografia fiecărei secțiuni a fost numărată de trei ori.

    Ori de câte ori este posibil, imunohistochimia trebuie confirmată prin Western blot pentru a verifica existența epitopilor cu dimensiunea moleculară așteptată.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.