Compoziția corpului și analiza cușcării metabolice în protocolul de șoareci cu conținut ridicat de grăsimi
rezumat
Acest protocol descrie utilizarea unei analize a compoziției corpului și a unui sistem de monitorizare metabolică a animalelor pentru a caracteriza compoziția corpului și parametrii metabolici la șoareci. Un model de obezitate indus de hrănirea bogată în grăsimi servește ca exemplu de aplicare a acestor tehnici.
Abstract
Modificările în compoziția corpului (grăsime sau masă slabă), parametrii metabolici, cum ar fi consumul de oxigen al întregului corp, consumul de energie și utilizarea substratului, precum și comportamentele precum consumul de alimente și activitatea fizică pot furniza informații importante cu privire la mecanismele de bază ale bolii. Având în vedere importanța compoziției corpului și a metabolismului, dezvoltarea obezității și sechelele ulterioare ale acesteia, este necesar să se ia măsuri precise ale acestor parametri în cercetările preclinice. Progresele tehnologice din ultimele decenii au permis ca aceste măsuri să fie derivate în modele de rozătoare într-un mod non-invaziv și longitudinal. Ca rezultat, aceste măsuri metabolice s-au dovedit utile în evaluarea răspunsului la manipulări genetice (de exemplu, șoareci knockout sau transgenici, knockdown viral sau supraexprimarea genelor), screening experimental de medicamente/compuși și activitate dietetică, comportamentală sau fizică Intervenții. Aici descriem protocoalele pentru măsurarea compoziției corpului și a parametrilor metabolici folosind un sistem de supraveghere a animalelor la șoareci hrăniți cu hrană și cu hrană bogată în grăsimi.
Introducere
Multe aspecte ale fiziologiei normale a celulelor, organelor și întregului corp stau la baza metabolismului. Ca rezultat, în stabilirea diferitelor boli, modificările metabolismului pot contribui direct la boala de bază sau pot fi compromise ca efect secundar al patologiei. În mod tradițional, studiile metabolice și studiile privind echilibrul energetic s-au concentrat pe domeniul obezității și condiții conexe, cum ar fi rezistența la insulină, prediabet, intoleranță la glucoză, boli cardiovasculare și diabet. Această cercetare este justificată în lumina prevalenței crescânde a unor astfel de condiții la nivel mondial și a costurilor individuale, sociale și economice pe care aceste condiții le cauzează. Astfel, dezvoltarea strategiilor de prevenire și a noilor terapii pentru a viza obezitatea este un obiectiv continuu în laboratoarele de cercetare din întreaga lume, iar modelele preclinice de șoareci se bazează în mare măsură pentru aceste studii.
În acest protocol oferim o descriere simplă a utilizării unei analize a compoziției corpului pentru a evalua compoziția corpului la șoareci și un sistem de monitorizare metabolică a animalelor pentru a măsura aspectele metabolismului. Considerațiile și limitările pentru aceste tehnici sunt discutate alături de metodele sugerate de analiză, interpretare și prezentare a datelor.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate experimentele descrise au fost aprobate de Alfred Medical Research Education Precinct Animal Ethics Committee (AMREP AEC) și șoarecii au fost îngrijiți în mod uman în conformitate cu liniile directoare ale Consiliului Național de Sănătate și Cercetare Medicală (NHMRC) Australia privind testarea pe animale. Animalelor li s-a dat dieta și apa prescrise ad libitum și situate într-un mediu cu temperatură controlată (
21-22 ° C) cu un ciclu de lumină de 12 ore și 12 ore de întuneric. Șoarecii masculi de șapte săptămâni (pe fundal C57Bl/6J) au fost fie hrăniți în mod regulat cu o dietă normală de chow (conținut energetic 14,3 MJ/kg, constând din 76% din kJ din carbohidrați, 5% grăsimi, 19% proteine; vezi tabelul de Materiale) sau pentru grupul cu hrană bogată în grăsimi, o dietă bogată în grăsimi (HFD) () conținut energetic 19 MJ/kg, constând din 36% carbohidrați, 43% grăsimi, 21% proteine, hrană specială kJ) timp de 3 săptămâni. Compoziția greutății corporale și a înălțimii cu un aparat EchoMRI s-a făcut săptămânal în timp ce monitorizarea analizei metabolice într-o scoică s-a făcut după 3 săptămâni de dietă.
(1) Procedura de analiză a compoziției corpului
Notă: Pentru a funcționa optim, EchoMRI 4-în-1 utilizat în acest protocol ar trebui să fie conținut într-o cameră în care temperatura aerului este stabilă și nu fluctuează. În mod ideal, acest lucru ar trebui monitorizat constant. Dacă este posibil să treceți la mașină, trebuie evitate întreruperile. Dacă sursa de alimentare a fost întreruptă și sistemul trebuie repornit, lăsați cel puțin 2-3 ore ca mașina să se încălzească înainte de a o utiliza din nou. Înainte de a începe, asigurați-vă că purtați echipament de protecție individuală corect.
2. Monitorizarea procedurii sistemului metabolic al animalelor
Notă: Sistemul necesită
2 ore pentru încălzire și stabilizare. Când mașina a fost oprită, aceasta trebuie pornită, astfel încât celula de oxid de zirconiu să poată fi încălzită la 725 ° C. De asemenea, așezăm de obicei șoareci în analizorul de compoziție corporală cu o zi înainte de a intra în animal, sistemul de monitorizare, probleme cu Reticența de a evita stresul.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Rezultatele din Figura 3 poate fi văzut pentru a indica o modificare tipică a parametrilor compoziției corpului la hrana cu conținut ridicat de grăsimi, măsurată prin EchoMRI. La început nu a existat nicio diferență în niciun parametru măsurat (Fig. 3A-F.). Cu toate acestea, după doar o săptămână de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi, a existat o creștere semnificativă a greutății corporale, a masei grase și a procentului de masă grasă în grupul HFD (Fig. 3A,B.,D.). Amploarea diferențelor dintre cele două grupuri pentru aceste măsuri a continuat să crească pe parcursul intervenției dietetice de 3 săptămâni. Masa musculară, apă liberă și conținutul total de apă (Figura 3,E.,F.) nu diferențiază grupurile în niciun moment. Se poate observa, de asemenea, că șoarecii Chow au continuat să câștige în greutate în perioada de studiu (Figura 3A) hrănit, aceasta a reprezentat o creștere a masei slabe (Figura 3) în loc să mărească o masă de grăsime (Fig. 3 b).
RER a fost semnificativ mai scăzut la șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi, indicând utilizarea grăsimilor față de utilizarea carbohidraților atunci când dieta bogată în grăsimi (Fig. 5A) hrănit. Consumul de energie (căldură) fără normalizare a fost animalele mai grele, probabil din cauza țesutului animal mai activ din punct de vedere metabolic (Fig. 5b), cu această diferență pierdută odată normalizată cu greutatea corporală (Figura 5) elevat. Rețineți, de asemenea, creșterile VO2, RER și a cheltuielilor de energie în ciclul întunecat, comparativ cu ciclul luminii atunci când șoarecii sunt mai activi. Aceste diferențe reprezintă modificările zilnice clasice ale metabolismului care apar la șoareci. În timp ce în acest exemplu am împărțit datele în blocuri de 12 ore, împărțirea datelor în epoci mai mici poate fi, de asemenea, utilă. Activitatea fizică este, de asemenea, un factor care contribuie la cheltuirea energiei. Acestea nu au diferit între grupuri, sugerând că o scădere a exercițiilor fizice nu a fost motorul fenotipului obez la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi (Figura 5).
statistici
Toate datele din acest document sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Semnificația statistică a continuat la p Figura 1 : Plasarea corectă a costurilor mouse-ului și a deținătorilor de probe de animale mici cu șoareci în analiza corpului compoziției. Efectuați un test de sistem cu o calibrare standard (cost) sau pentru scanarea șoarecilor din suportul de probă pentru animale mici, fiecare în sistemul portic. Săgețile roșii arată cilindrul în care șoarecii vor fi conținuți în holul ipostil al mașinii.
Figura 2 : Asamblarea camerelor individuale. (A) așezați recipientul pentru alimente în mijlocul cântarului. B) așezați platforma în fiecare cameră și așezați camera peste pâlnie. C) Șoarecii din camere individual și acoperiți. D) poziționați și fixați sticla de apă.
Figura 3 : Analiza corporală a compoziției corpului în decurs de 3 săptămâni de dietă bogată în grăsimi. (A) greutate corporala, (B) Masa grasa, (C) respinge mulțimea, (D) Fracția de masă grasă, (E) Conținut de apă, gratuit și (F) Conținutul total de apă. Cercurile reprezintă diete chow normale, pătratele reprezintă HFD. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
Figura 4 : Parametrii metabolici obținuți din sistemul de monitorizare a animalelor metabolice după 3 săptămâni de diete respective. Șoarecii au fost adăpostiți în camere timp de 48 de ore cu primele 24 de ore ca inducție. Datele din a doua 24 de ore au fost analizate și prezentate în aceste numere. (A) Prețuri VO2 brute, B) VO2 normalizat la greutatea corporală (C) VO2 normalizat la masa musculară, (D) Scatterplot pentru VO2 neajustat (perioada totală de 24 ore) cântărire corporală, t și (E) masa corporală slabă VO2 neajustată. A-C Barele albe reprezintă o dietă normală, iar barele negre reprezintă o dietă bogată în grăsimi. D-E Cercurile reprezintă diete chow normale, pătratele reprezintă HFD. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
Figura 5 : A) Raport de schimb respirator (RER), (B) Căldură (consum de energie) și (C) Căldura normalizată la greutatea corporală. D) Nivelul de activitate calculat ca suma fasciculului ambulator X și Y, pauzelor și pauzelor fasciculului Z. Barele albe reprezintă o dietă normală; bare negre reprezintă HFD.
Figura 6 : Date privind aportul de alimente în sistem pentru ultimele 24 de ore. (A) Aportul alimentar în grame, (B) Aportul alimentar normalizat la greutatea corporală și (C) consumul de energie calculat. n = 4-5 (3 șoareci au fost excluși din cauza unei mari mizerie cu mâncarea lor). Barele albe reprezintă o dietă normală; bare negre reprezintă HFD. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Pași importanți
Protocoalele descrise aici vă oferă un exemplu de măsurare a compoziției corpului și a diferiților parametri metabolici la șoareci utilizând o analiză a compoziției corpului și un sistem de monitorizare metabolică a animalelor. Pentru ambele tehnici, este esențial să se asigure că mașinile funcționează optim și, pentru a face acest lucru, este imperativ ca cercetătorul să efectueze un test de compoziție fizică pentru analiza corpului și să fie calibrat pe o compoziție de gaz cunoscută pentru sistemul de monitorizare a animalelor metabolice. a echipamentului. Acest lucru oferă o mai mare consistență în rezultate și capacitatea de a identifica potențiale probleme cu mașina.
Modificări și remedieri de erori
restricții
Aplicații viitoare
În timp ce în această postare am folosit obezitatea dobândită prin hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi ca exemplu de afecțiune în care măsurarea compoziției corpului și parametrii metabolici sunt utile, utilizarea acestor dispozitive este departe de a fi limitată la acest domeniu de cercetare. Utilizarea acestor tehnici este, de asemenea, valoroasă atunci când se studiază boli precum diabetul, bolile cardiovasculare, sarcopenia legată de vârstă, fragilitatea, cașexia cancerului, distrofia musculară și lipodistrofia. În timp ce costul inițial al achiziționării unei astfel de infrastructuri este substanțial, capacitatea de a utiliza dispozitivul în mai multe și diferite domenii ale cercetării medicale atenuează acest cost inițial. În plus, costurile de reactivi și consumabile pentru aceste mașini sunt minime; Cu toate acestea, întreținerea și întreținerea preventivă trebuie luate în considerare și bugetate.
Metodele descrise în această lucrare pot fi utilizate pentru a caracteriza compoziția corpului și diferiți parametri metabolici la șoareci. Aceste măsuri se aplică unui număr mare de domenii de cercetare și oferă informații importante pentru caracterizarea unui fenotip. Datele din aceste metode pot indica, de asemenea, către mecanisme care stau la baza unui anumit fenotip metabolic. Dezvoltarea și perfecționarea ulterioară a acestor tehnologii permite cercetătorilor să-și avanseze concluziile către rezultate terapeutice.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.