Consiliul Director Prof.
De la Clinica medicală pentru animale mici, catedră pentru medicină internă pentru animale de companie mici și animale de companie de la Facultatea de Medicină Veterinară a Universității Ludwig Maximilians din München. Katrin Hartmann Realizat sub conducerea prof. Dr. Katrin Hartmann Factori genetici și nutritivi în dezvoltarea diabetului zaharat la câini: Studii asupra polimorfismelor în patru gene candidate și privind aprovizionarea cu vitamina D Disertație inaugurală pentru obținerea unui doctorat veterinar de la facultatea veterinară a Universității Ludwig Maximilians din München prezentată de Jannis Uhrig din Karlsruhe München 2007
Tipărit cu aprobarea Facultății de Medicină Veterinară a Universității Ludwig Maximilians din München Decan: Vorbitor: Co-arbitru: Prof. univ. Dr. E. P. Märtlbauer Univ.-Prof. Dr. Hartmann Prof. Dr. Ziua doctoratului Goldberg: 20 iulie 2007
Știm ce face florile să crească, dar nu știm de ce avem toți cunoștințele ADN-ului, dar murim totuși Justin Sullivan Declararea îndoielii ca filozofie a vieții este ca alegerea opririi ca mijloc de transport Yann Martel În memoria mama mea
4.5. Măsurarea nivelurilor de 25 (OH) de vitamina D 3. 61 4.6. Măsurarea nivelurilor de 1,25 (OH) 2 de vitamina D 3. 62 V. Discuție. 64 1. Compararea metodelor de genotipare. 64 2. Etiologia diabetului zaharat la oameni și câini. 65 2.2 Factori genetici pentru dezvoltarea diabetului zaharat. 65 2.3 Starea vitaminei D ca factor nutritiv în dezvoltarea diabetului. 68 3. Limitările acestui studiu. 69 3.1. Numărul animalului. 70 3.2. Colectiv de pacienți. 70 3.3. Grupul de control. 71 3.4. Design de studiu. 72 4. Relevanța prezentului studiu. 72 5. Outlook. 73 VI. Rezumat. 76 VII. VIII. Rezumat. 78 Bibliografie. 80
Lista alfabetică a abrevierilor 7-DHC: 7-dehidrocolesterol ADA: American Diabetes Association VÂRSTĂ: Produs final glicozilat avansat ALP: Alanină-Aminotransferază AP: Fosfatază alcalină APC: Celulă care prezintă antigen ARMS: Sistem de mutație refractară de amplificare CTLA4: Citogen T-limfocit antigen 4: Prag de ciclu DDG: Societatea germană de diabet DKA: Cetoacidoză diabetică DLA: Antigen leucocitar câine D. m.: Diabet zaharat EDTA: Acid etilendiaminetetraacetic EPI: Insuficiență pancreatică exocrină GAD65: Glutamat decarboxilază umană GH: Hormon de creștere HGVS: Antigen leucocitar IA-2/ICA-512: tirozin fosfatază IBD: boală inflamatorie intestinală ICA: antigen celular insulin IDD: deficit de insulină Diabet IDDM: diabet insulinodependent mellit IFN-γ: interferon-γ IL-2: interleukină-2 IRD: Diabet cu rezistență la insulină ISAG: Societatea internațională pentru genetică animală LADA: Diabet latent autoimun la adulți LYP: Limfoid-tirozină-fosf atase MHC: Complex major de histocompatibilitate MODY: Maturity Debut Diabetul tânărului MS: Scleroză multiplă
NADPH: nicotinamidă adenină dinucleotidă redusă NIDDM: diabet zaharat non-insulinodependent NO: oxid nitric SAU: raport de cote NPH: izofan-insulină PCR: polimerază în lanț PP: polipeptidă pancreatică PTH: hormon paratiroidian PZI: protamină-zinc-insulină RXR: Receptor retinoid X SD: deviație standard SNP: polimorfism nucleotidic unic T1DM: diabet zaharat tip I TBE: TRIS-borat-EDTA TE: TRIS-EDTA TGF-β: factor de creștere transformant β TNF-α: factor de necroză tumorală-α VDR: vitamina D- Receptor VDRE: Elemente sensibile la vitamina D VIP: polipeptidă intestinală vasoactivă VUW: Universitatea de Medicină Veterinară, Viena OMS: Organizația Mondială a Sănătății
II. Revizuirea literaturii 4 Microscop electronic cu opacitate omogenă, granulele mici sunt stocate și reprezintă aproximativ 5% din celulele insulelor. Cel mai mic și foarte eterogen grup de celule pancreatice endocrine, celulele PP, secretă hormoni polipeptidici gastroenteropancreatici, de exemplu polipeptida pancreatică (PP) sau polipeptida intestinală vasoactivă (VIP). Celulele endocrine ale pancreasului sunt înconjurate de o rețea densă de capilare fenestrate și își eliberează secreția în sânge prin exocitoză. Nu se pot distinge prin colorarea hematoxilinei-eozinei, dar pot fi identificate foarte bine prin colorarea imunohistochimică a hormonilor pe care îi produc (MOSIMANN & KOHLER, 1990; SINOWATZ, 2000; BÖCK & LIEBICH, 2004). 1.3. Insulina Insulina este un hormon peptidic cu o mare omologie între diferitele specii de mamifere. Insulina pentru câini este identică în secvența sa cu insulina de porc (www.ebi.ac.uk/swissprot). Acționează prin receptorul său atât asupra homeostaziei glucozei, cât și asupra metabolismului grăsimilor, proteinelor și corpurilor cetonice. 1.3.1. Formarea insulinei și secreția de insulină Insulina se formează ca pre-pro-insulină în celulele ß ale pancreasului și la câini este formată din 106 aminoacizi care formează o secvență semnal, precum și un lanț A și B, care este legat de o verigă intermediară, așa-numitul Peptida care trebuie legată. Proinsulina de 82 aminoacizi se formează prin împărțirea secvenței semnal și formarea a trei punți disulfură. În cursul ulterior al procesului, peptida C este separată și insulina rezultată, care la câini este formată din 51 de aminoacizi (SMITH, 1966) legați la un ion de zinc ca hexamer, este stocată în granule pe suprafața celulei și, ca răspuns la creșterea nivelului de zahăr din sânge, Peptida este secretată în fluxul sanguin în cantități echimolare. Deoarece formarea insulinei din precursorii săi prin așa-numitele convertaze prohormonice are loc doar în granulele de stocare, dacă secreția de insulină este rapidă, proinsulina este eliberată și în sânge; are însă o activitate biologică redusă. Mai mult, diverse proteine din granule intră în circulație. Celor mai mulți li se atribuie un rol în stabilirea condițiilor optime de stocare și procesare a insulinei. Cu toate acestea, nu se poate exclude faptul că unele dintre ele pot prezenta și activitate biologică. unu
II. Revizuirea literaturii 8, precum și îngustarea capilarelor din glomerul și retină. Această reacție biochimică contribuie probabil la o mare parte din daunele cunoscute și temute pe termen lung ale D. m. cum ar fi ateroscleroza, nefropatia diabetică și retinopatia diabetică în (VLASSARA și colab., 1986). Deoarece toate aceste complicații se dezvoltă doar pe parcursul mai multor decenii, acestea sunt clinic mai puțin importante pentru câini (FELDMAN și NELSON, 2004). Consecințele pe termen lung ale lui D. m. sunt descrise în secțiunea 1.6.3. tratat. Cu niveluri normale de zahăr din sânge, doar aproximativ 3% din glucoză este descompusă prin așa-numita cale sorbitol de către enzima aldoză reductază la sorbitol și în cele din urmă la fructoză. În starea hiperglicemiantă, această valoare crește până la 30%. Deoarece NADPH (nicotinamidă adenină dinucleotidă) este consumat atunci când glucoza este descompusă prin calea poli-inozitolului, apare o deficiență de NADPH în celulă. NADPH este un substrat pentru glutation peroxidază, care protejează celula de radicalii liberi și, astfel, de daunele cauzate de stresul oxidativ. În acest fel, o activitate crescută a aldozei reductazei, despre care se suspectează că este implicată în formarea AGE-urilor, ar putea deteriora endoteliile vasculare și astfel ar putea duce la complicațiile D. m. contribuie la oameni (SRIVASTAVA și colab., 2005). Aceste mecanisme par să existe și la D. m canin. de o importanță minoră datorită duratei scurte de viață a câinelui, cu toate acestea, calea sorbitolului pare să joace un rol important în formarea cataractei diabetice atât la câini, cât și la oameni (LIGHTMAN, 1993; WILKIE și colab., 2006). 1.5. Epidemiologia diabetului zaharat canin Conform unui studiu din SUA care a analizat retrospectiv distribuția raselor câinilor cu D. m. comparativ cu distribuția raselor de câini prezentate în aceeași clinică din alte motive, douăsprezece rase au avut un risc deosebit de mare de a avea un D. m. să se dezvolte (Australian Terrier, Schnauzer mediu, Samoyede, Schnauzer miniatură, Fox Terrier, Keeshond, Bichon Frise, Finnenspitz, Cairn Terrier, Pudel miniatură, Husky siberian, Pudel jucărie). Majoritatea câinilor aveau între cinci și zece ani la momentul diagnosticului; D. m. Avea cea mai mare prevalență. în grupa de vârstă între unsprezece și 15 ani (GUPTILL și colab., 2003).
II. Revizuirea literaturii 10 1993). Hiperlipidemia este o constatare de laborator care poate fi adesea observată, deoarece lipoliza crescută în sânge duce la niveluri crescute de acizi grași liberi atunci când există o lipsă de insulină. Hiperlipidemia duce la creșterea stocării grăsimilor în ficat și, astfel, la lipidoza hepatică (JAMES & DAY, 1999). Acest lucru duce la o creștere a activității enzimelor hepatice fosfatază alcalină (AP) și alanin aminotransferază (ALT). Într-un studiu cu 208 câini cu D. m. 90% dintre toți câinii au prezentat o creștere a activității AP și 78% o creștere a activității ALT, la 42% dintre câini serul a fost lipemic (HESS și colab., 2000). 1.6.2. Boli subiacente Influențele hormonale, administrarea medicamentelor și bolile pancreasului și ale altor organe pot duce la D. m. a conduce. În principiu, o rezistență la insulină pe bază de D. m. reversibil, iar în acele cazuri în care există hiperadrenocorticism sau o nevoie crescută de insulină în diostru, trecerea de la un tranzitor la un D. manifest permanent se poate realiza uneori prin tratarea în timp util a bolii subiacente sau castrarea imediată. a fi evitat. În majoritatea cazurilor, însă, prea multe celule β au pierit deja din cauza toxicității glucozei sau epuizării capacității lor de secreție pentru a menține o secreție de insulină suficientă, astfel încât D. m reversibil. diabetul ireversibil cu deficit de insulină devine (FELDMAN și NELSON, 2004; NORMAN și colab., 2006). 1.6.2.1 Pancreatita acută și cronică Pancreatita acută sau cronică sunt boli frecvente care duc la distrugerea celulelor endocrine ale pancreasului și, astfel, la lipsa secreției de insulină; rareori apar neoplasmele pancreasului exocrin (ALEJANDRO și colab., 1988). Pancreatita acută tinde să conducă la distrugerea rapidă a celulelor β și, astfel, la lipsa secreției de insulină, în timp ce pancreatita cronică este cel mai important motiv pentru rezistența la insulină cauzată de inflamație (FELDMAN și NELSON, 2004). 1.6.2.2.Hiperadrenocorticism Glucocorticoizii, fie produși de organism, fie furnizați iatrogen, conduc la o creștere a nivelului de zahăr din sânge prin glicogenoliză și gluconeogeneză crescute. În acest fel, acționează ca un antagonist al insulinei și pot duce astfel la D. m. a conduce. Mai mult, glucocorticoizii duc la o
II. Revizuirea literaturii 14 microalbuminurie, există o producție crescută de factor de creștere transformant β (TGF-β). Acest factor de creștere este responsabil pentru o depunere extracelulară crescută a proteinelor matricei în glomerul; aceasta duce la o îngroșare a membranei bazale și la o expansiune a mezangiului (SCHENA și GESUALDO, 2005). Deoarece durata fazei inițiale este de aproximativ cinci ani și nefropatia diabetică este complet dezvoltată numai după aproximativ 20 de ani, apare foarte rar din cauza duratei de viață mai scurte a câinilor domestici (STRIPPOLI și colab., 2003; FELDMAN și NELSON, 2004). 1.6.3.6 Cetoacidoza diabetică DKA este deraierea care pune viața în pericol a metabolismului organismului datorită unui D. m. Netratat sau slab controlat, caracterizat prin triada biochimică a hiperglicemiei, acidozei și cetozei. Așa cum s-a descris deja, lipsa de insulină și glucoză în celulele periferice ale corpului duce la creșterea lipolizei și la formarea corpurilor cetonice în ficat, deoarece acizii grași liberi sunt oxidați la acetil-CoA, care nu se adaugă ciclului acidului citric din cauza lipsei de glucoză din celulă. și este metabolizat în acizi slabi acetonă, acetoacetat și β-hidroxibutirat. Acest efect este intensificat de concentrațiile crescute de hormoni antagonici ai insulinei (în special glucagon și glucocorticoizi) și creșterea gluconeogenezei și glicogenolizei duc la o creștere suplimentară a nivelului de zahăr din sânge. Acest lucru duce la diureză osmotică, pierderea electroliților și deshidratare (SONKSEN & SONKSEN, 2000; GOODMAN, 2003). Corpurile cetonice pot fi utilizate de multe celule ale corpului, inclusiv de cele din creier, pentru a genera energie, dar dacă sunt formate în exces, ele contribuie la deraierea gravă a metabolismului organismului. Aceștia acționează ca acizi slabi și, prin urmare, duc la epuizarea sistemelor tampon din sânge și, astfel, la acidoză metabolică. Acestea sunt filtrate liber prin glomerul și, datorită hidrofilicității lor, cresc diureza osmotică. Datorită încărcării negative a corpurilor cetonice, cationii precum sodiul și potasiul, dar și calciul și magneziul, sunt secretați din sânge în urină pentru a menține neutralitatea electrică a sângelui. Acest lucru duce la epuizarea sodiului și potasiului în organism și la o deshidratare severă. Dacă nu există un influx de glucoză în celulele corpului, nu poate pătrunde potasiu în celulă, deoarece acest lucru se poate face cu ajutorul unui
III. Material sau metode 40 sau au fost trimise la clinică de către medicii generaliști numai atunci când au apărut complicații. 1.1.3. Distribuția raselor și a sexului 13 câini au fost rase mixte; cei mai frecvent reprezentați câini genealogici au fost teckelii, terrierii și pudelii albi din West Highland (câte patru pacienți fiecare) și ciobanii germani (trei pacienți, vezi tabelul 2). Rase de terrier mici (West Highland White Terrier, Yorkshire Terrier, Jack Russel Terrier precum și Welsh Terrier și Scotch Terrier cu un total de zece pacienți) au fost reprezentate cel mai frecvent. Rasele de câini de la Clinica medicală pentru animale mici din München sunt enumerate separat în fila 3 pentru a le putea compara cu cele mai frecvente rase ale întregii populații de pacienți din clinica medicală pentru animale mici în perioada de studiu. 28 de câini cu D. m. au fost femele, dintre care 15 au fost castrate și 13 nu au fost castrate, 23 de câini cu D. m. erau bărbați, unsprezece sterilizați și doisprezece nu sterilizați. Tab. 2: Cele mai frecvente rase de câini cu diabet zaharat (întreaga populație din studiu) Numărul rasei Rasa mixtă 13 Teckel 4 Caniche 4 West Highland White Terrier 4 Rottweiler 3 Ciobanesc german 3 Yorkshire Terrier 2 Jack Russel Terrier 2 Altele 16
III. Materiale și metode 50 amplificate. Deoarece eficiența de legare a primerilor a fost diferită, valorile C t au diferit în ciuda aceleiași cantități de ADN din diferitele alele, motiv pentru care un Ct 1 C) ar trebui să difere în ceea ce privește temperatura lor de topire. Temperatura optimă de recoacere și concentrația primerilor specifici alelelor trebuie optimizate în mai multe teste preliminare (LINDBLAD-TOH și colab., 2005). O abordare funcțională ar putea fi stabilită numai pentru unul dintre SNP-uri; primerii și condițiile de reacție sunt date în Tab. PCR a fost efectuat pe plăci cu 96 de godeuri (Plăci PCR Gold Thermowell, Corning Inc., Corning, SUA) cu un ciclotermic AB 7300 (Applied Biosystems, Foster City, SUA). PCR a fost urmată de o etapă de disociere în care temperatura de topire a produselor PCR a fost determinată utilizând un gradient de temperatură (60-95 C). Fie primul derivat negativ al curbei de fluorescență a arătat un vârf la temperatura de topire mai scăzută, apoi ampliconul mai scurt a fost amplificat și proba a conținut adenină sau timină la locul SNP, sau a existat un vârf cu o temperatură mai mare, atunci proba a fost homozigotă pentru guanină sau citozină. Animalele heterocigote au prezentat două vârfuri, câte un vârf la temperatura corespunzătoare. Primerii au fost obținuți de la Operon Biotechnologies GmbH din Köln, Germania. A fost folosit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, SUA). Pentru a putea compara această nouă metodă de genotipare cu ARMS-PCR, SNP V7 a fost genotipat folosind ambele metode.
III. Materiale și metode 55 Tab. 9 SNP V7 Meltingcurve-PCR; Primer, program PCR, amestec de reacție, imprimat cu caractere aldine: Schimb de bază Primer 1 (specific alelelor) GCGGGCAGGGCGGCCCTGGCTAGCCCTGAC Primer 2 (specific alelelor) GCGGGCCCTGGCTAGCCCTGAT grund comun AGTCAGGTGCCCTCCTCCTTTGG Începutul ciclului 95 60 sec sinteză 72 C 30 sec lot H 2 O 7,8 µl (20 µl) primer 1 (10 µm) 0,4 µl primer 2 (5 µm) 0,4 µl primer comun (10 µm) 0,4 µl 2x SYBR-Green Mastermix 10 pl ADN-șablon 1 pl 2.8. Statistici Evaluarea statistică a fost efectuată cu SPSS pentru Windows, versiunea 13.01 (SPSS Inc., Chicago, SUA). Testul t Student nepereche a fost utilizat pentru a compara valorile medii ale vitaminei D și testul χ 2 pentru a compara frecvențele alelei. Un p de 0,05 a fost considerat semnificativ. Analiza rezistenței testului și a numărului necesar de animale a fost efectuată cu Power And Precision (Biostat Inc., Englewood, SUA).
IV. Rezultate 56 IV. Rezultate 1. Perechile Primer de secvențiere au fost create pentru un total de 18 secțiuni ale genelor VDR, CTLA4, LYP-PNP și DLA, secțiunile au fost amplificate cu ajutorul PCR și ADN-ul purificat, reprodus, a fost secvențiat. Perechile de grund au fost alese astfel încât să se amplifice cât mai multe porțiuni din toți exonii și limitele exon-intron. 1.1. Secvențierea genei receptorului de vitamina D Când s-au comparat segmentele genetice secvențiate, au fost găsite șapte SNP în gena VDR, trei dintre ele în introni, trei în exoni și una în regiunea 5 netradusă (Fig. 1). Fig. 1: Polimorfisme (săgeți) nucleotidice unice în gena receptorului vitaminei D (regiuni de codificare (exoni) prezentate de casetele gri) 1.2. Secvențierea genei antigenului limfocitelor T citotoxice 4 Au fost găsite două SNP în gena CTLA4, una în exonul 2 și una în exonul 4 (FIG. 2). Fig. 2: Polimorfisme (săgeți) nucleotidice unice în gena citotoxică a antigenului limfocitar T 4 (zone de codificare (exoni) prezentate de casetele gri)
IV. Rezultate 57 1.3. Secvențierea genei limfoide tirozin fosfatazei Un SNP a fost găsit în gena LYP, a fost localizat în exonul 13 și a dus la un schimb de aminoacizi (fenilalanină> leucină). Fig. 3: Polimorfisme (săgeți) nucleotidice unice în gena limfoidă tirozin fosfatază (zone de codare (exoni) prezentate de casetele gri) Toate SNP-urile cu locația exactă și denumirea în conformitate cu nomenclatura Societății de Variație a Genomului Uman (HGVS) listate în Tab. 10. Tab. 10 Localizarea polimorfismelor nucleotidice unice (SNPs) (UTR = Regiune netradusă, AS-Aust. = Schimb de aminoacizi, PPA = Primer-Probe-Assay, ARMS = Amplicon Mutation Refractory System-PCR, TM = Meltingcurve-PCR, Phe = Phenylalanine, Leu = leucina) gena regiunii SNP AS-Aust. PCR V1 c.-21t> c 5 'UTR VDR - PPA V7 c.501 + 3310A> G Intron 3 VDR - ARMS/TM V8 c.501 + 3434c> t Intron 3 VDR - ARMS V9 c.533c> t Exon 4 VDR - secvențiat V10 c.677t> c exon 5 VDR - ARMS V11 c.761t> c exon 5 VDR - ARMS V13 c.1150 + 1580a> g intron 7 VDR - ARMS C1 c.372c> t exon 2 CTLA4 - PPA C2 c.958a> g exon 4 CTLA4 - ARMS LYP c.2344a> t exon 13 LYP-PNP Phe> Leu PPA