Cuantificarea spațială a medicamentelor în leziunile tuberculozei pulmonare prin microdisecție cu captare laser

rezumat

Aici descriem un protocol care utilizează microdisecția de captare cu laser asociată cu analiza LC/MS pentru a cuantifica distribuțiile spațiale-medicamente în granuloamele tuberculoase pulmonare. Această abordare are o largă aplicabilitate pentru a cuantifica concentrațiile de medicamente în țesuturi la detalii spațiale ridicate.

Abstract

Introducere

Capacitatea de a rezolva spațial și de a cuantifica nivelurile medicamentelor este esențială pentru a determina dacă medicamentele antituberculoză ajung la subpopulații bacteriene în cadrul leziunilor pulmonare la concentrații de sterilizare 1. O importanță deosebită este pătrunderea medicamentului în nucleul necrotic al leziunii (numit caseum), determinând care conține de obicei cel mai mare număr de bacili și, eventual, medicamente slab accesibile din cauza lipsei de vascularizație.

Metodele tradiționale de penetrare a leziunilor, care evaluează omogenizarea leziunilor pulmonare excizate, urmate de extracția solventului și analiza preocupării cromatografiei lichide-spectrometrie de masă (LC/MS), sunt foarte sensibile și selective pentru medicamentele de interes. Cu toate acestea, aceste metode oferă informații spațiale slabe, limitate la dimensiunea țesutului omogenizat original. Abordările imagistice bazate pe spectrometrie de masă, cum ar fi ionizarea cu desorbție laser matricială (MALDI) 2, 3, ionizarea prin desorbție prin electrospray (DESI) 4 sau extracția cu suprafață extinsă cu lichid 5, 6 oferă capacități de imagistică foarte rezolvate spațial, dar cuantificarea directă poate fi extrem de dificilă sau imposibil din cauza efectelor eterogene de suprimare a ionilor și a diferitelor eficiențe de extracție a analiților din celula sau țesutul individual 7. În plus, majoritatea abordărilor imagistice directe ale țesutului MS sunt inerent mai puțin sensibile decât LC/MS datorită lipsei de separare cromatografică a speciilor endogene care concurează pentru ionizare și eficienței mai scăzute a extracției solventului medicamentului din țesut.

Acest protocol descrie combinația puternică de profilare spațială și cuantificare completă a LCM-LC/MS, oferind concentrații absolute de medicament în toate compartimentele granuloamelor TB oferite. Tehnica poate fi, de asemenea, aplicată pentru a determina concentrațiile de medicamente în multe țesuturi diferite bolnave pentru a informa descoperirea și dezvoltarea vitală a medicamentelor.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate testele pe animale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator cu permisiunea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (NIH), Bethesda, MD.

(1) Testarea animalelor și colectarea țesuturilor

Această secțiune a protocolului descrie procedurile la animale și condițiile de colectare a specimenelor Nivelul de securitate biologică 3 (BSL3). Pentru protocoalele detaliate ale procedurii de infecție cu aerosoli Mycobacterium Tuberculosis și administrarea medicamentelor, protocoalele la iepuri au fost descrise anterior 11, 12 .

(4) Extragerea și analiza LCMS

5. validarea metodei

Creați un omogenizat în controlul țesutului pulmonar prin combinarea 1 parte de plămâni, 2 părți de PBS și 3-4 margele de oțel. Bateți țesutul pulmonar și tamponul PBS timp de 5 minute la 1750 rpm cu un omogenizator de margele.
Puneți omogenatul prin adăugarea a 10 µL de 1 mg/mL etambutol DMSO stoc în 990 µL omogenizat pentru a crea o concentrație finală de 10.000 ng/mL (10 mg/mL) și vortex timp de 1 minut.
Creați un bloc de omogenizare înghețat turnând omogenatul într-un Cryomold și înghețându-l rapid pe gheață uscată timp de 5 minute.
Pregătiți secțiuni groase de 25 µm din blocul de omogenizare așa cum este descris la 2.1-2.5.
Disecați țesutul țintă așa cum este indicat în pașii 3.2-3.10.
Adăugați 10 µL 1: 1 acetonitril/apă și 2 µL tampon PBS în tuburile cu țesut microdisecat.
Adăugați 50 pl din soluția de extracție în fiecare tub. Pași pentru crearea unei curbe standard și determinarea concentrației medicamentului în blocul omogenizat tisular 4.9-4.12.
Calculați eficiența extracției folosind următoarea formulă:

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

O imagine de ansamblu a abordării LCM-LC/MS este prezentată în Figura 1afișate. După ce țesutul a fost sterilizat prin iradiere gamma, toate etapele ulterioare (tăierea țesutului) au loc în afara condițiilor BSL3. Figura 2 prezintă secțiunile biopsiei leziunii înainte și după țesutul izolat din LCM. Zonele necrotice și celulare ale leziunilor TB pot fi ușor identificate și izolate prin inspecția vizuală a imaginilor optice singure (fără a fi necesară referirea la secțiuni adiacente colorate histologic). Procesul de disecție creează o incizie curată cu întreruperi minime ale țesutului înconjurător și disecarea a 3 milioane µm 2 (3 mm 2) din fiecare regiune de interes din leziuni durează aproximativ 1 oră în total.

Am aplicat cuantificarea spațială LCM-LC/MS - multe medicamente anti-TB existente și noi în leziunile pulmonare. Figura 3A prezintă date eșantion de la iepuri infectați cu MTB, care au fost dozați în stare de echilibru cu etambutol. LCM-LC/MS a permis cuantificarea completă a medicamentului dizolvat în cazeum, leziuni celulare și zone de țesut pulmonar neimplicat. S-a observat că EMB pătrunde în leziune pentru a atinge concentrația de sterilizare în cazeumul necrotic. Imaginea corespunzătoare MALDI-MS dobândită de vânzările EMB din țesutul adiacent este prezentată în Figura 3 b. Imaginile calitative MALDI-MS s-au corelat bine cu datele cantitative LCM-LC/MS cu concentrații mai mici de medicament detectate în cazeo necrotic comparativ cu janta celulară. Datele LCM-LC/MS au fost validate prin comparație directă cu omogenatele de țesut analizate prin LC/MS standard.

ilustrația 1 : Proces schematic LCM-LC/MS. Biopsiile pulmonare de iepuraș cu leziuni necrotice împreună cu plămânii neimplicați din jur sunt colectate și înghețate. Criosecțiunile sunt tăiate pe membrane PET subțiri și leziunile pulmonare, celulare și cazeoase neimplicate sunt disecate și izolate pentru cuantificare prin LC/MS. adaptat de la Zimmerman și colab. 12 Vă rugăm să faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Figura 2 : Leziune (A, B) și plămân neimplicat (C, D) așa cum apar la microscop înainte (A, C) și după (B, D) microdisecție. Zonele leziunii cazeoase par mai întunecate și „crăpate” în scanarea optică a imaginii (A, contur verde). Leziunea celulară este mai deschisă la culoare și are o structură mai fermă (A, margine roșie). Plămânii neimplicați trebuie palpați la cel puțin 5 mm distanță de marginea leziunii și să apară de culoare roșu/roz (C, contur cyan). Barele de scalare (negru, albastru și violet) = 400 µm. Rețineți că numai zonele de plămâni neimplicate trebuie selectate pentru a evita includerea spațiilor alveolare și a bronhiolelor captate pe întreaga suprafață a țesutului (a se vedea d). Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Zona disecată (µm- 2)	Concentrația EMB (Ng/g) măsurată (n = 3)	Recuperare EMB (%) (n = 3)
3 milioane	10633 (± 404)	106 (± 4)
5 milioane	10057 (± 1132)	101 (± 11)
10 milioane	10563 (± 1128)	105 (± 11)

Tabelul 1: Eficiența extracției metodei LC-LC/MS pentru cuantificarea EMB în plămâni. Restaurarea completă a EMB a înregistrat țesutul pulmonar disecat omogenat dopat EMB pentru toate volumele de țesut evaluate.

ID-ul iepurelui	LC/MS EMB (ng/g)	LCM-LC/MS EMB (ng/g)	Diferență (%)
899	2910	3320	14
904	2010	1870	-Al 7-lea
911	2150	2370	9

Masa 2: Comparația cuantificării EMB a biopsiilor pulmonare neimplicate de la 3 iepuri dozați folosind LCM-LC/MS. și LC/MS Concentrații echivalente de medicament detectate prin metode și nu a fost observată nicio pierdere de semnal prin degradare sau aspirație în timpul procesului LCM-LC/MS.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Cuantificarea rezolvată spațial a medicamentelor din leziunile pulmonare de TB este necesară pentru a determina dacă expunerea la medicament a atins concentrații sterilizante ale populațiilor bacteriene care locuiesc în diferitele compartimente ale leziunilor. Metoda LCM-LC/MS descrisă aici permite cuantificarea absolută a medicamentelor anti-TB la toți subiecții leziunii, inclusiv cazeumul bogat în bacterii, cu doar 1-3 secțiuni de țesut în total. Omogenizarea tradițională a țesuturilor și abordările LC/MS de cuantificare a medicamentului în țesut lipsesc adesea de caracteristicile spațiale pentru a aborda compartimentele leziunii specifice și chiar și atunci când este posibil, există un potențial semnificativ de contaminare a celulelor încrucișate și zone de leziuni necrotice în timpul extracției manuale.

Protocoalele de colorare a țesuturilor sunt de obicei utilizate înainte de LCM pentru aplicații proteomice pentru a permite identificarea ușoară a zonelor de țesut și localizate în populațiile de celule. Petele histochimice de rutină precum B. H&E nu sunt compatibile cu cuantificarea medicamentului, deoarece multe etape de spălare cu solvent implicate ar duce medicamentul din secțiunea de țesut la alta. Semifabricatele adiacente pot fi colorate cu H&E și utilizate ca ghid pentru microdisecție. Cu toate acestea, acest lucru nu este de obicei necesar, deoarece compartimentele pentru leziuni pot fi vizualizate sub microscopul standard LCM cu câmp luminos (Figura 2) poate fi rezolvat.

Optimizarea etapelor de tăiere și microdisecție este esențială pentru cuantificarea cu succes a leziunilor. În timpul dezvoltării metodei, am evaluat două materiale membranare diferite, polietilen tereftalat (PET) și polietilen naftalat (PEN) ca substraturi pentru asamblarea secțiunilor de țesut pentru microdisecție. Membranele PEN au suferit sarcini statice crescute în comparație cu membranele PET și aproximativ 30% din toate zonele tisulare disecate s-au pierdut din cauza atracției statice între membrană și regiunea țesutului disecat. Din acest motiv, membranele PET au fost selectate pentru disecții viitoare datorită atracției statice semnificativ reduse observate (doar 5% din regiunile disecate din membranele PET s-au pierdut în timpul LCM).

Densitatea regiunilor de țesut disecat este, de asemenea, o considerație importantă în cuantificarea nivelurilor de medicament pe baza zonei sau a volumului de țesut. Acest lucru are o importanță deosebită pentru biopsiile pulmonare și ale leziunilor, în care zonele țesutului pulmonar neimplicat au o densitate globală mai mică decât celula și cazeul (mai puține țesuturi care au aceeași zonă relativă) datorită prezenței bronhiolelor deschise multiple și a spațiilor alveolare. Efectele acestei diferențe de densitate pot fi atenuate privind cu atenție în jurul zonelor deschise, inclusiv în zona acumulată a țesuturilor colectate (așa cum se arată în Figura 2afișate).

O altă limitare este că metoda LCM-LC/MS prezentată cuantifică concentrația totală de medicament în țesutul izolat (împreună cu toate omogenizarea țesuturilor, extracția solventului și abordările de cuantificare LC/MS) și nu dizolvă concentrațiile medicamentului legate de proteine din pauzele nelegate. Microdializa este o abordare alternativă la cuantificarea medicamentului nelegat din țesut și permite cuantificarea exactă a concentrațiilor libere de medicament care ajung la populațiile extracelulare de bacterii 13. Cu toate acestea, tehnica ar fi aplicată cel mai bine ca o abordare complementară, deoarece nu are caracteristicile spațiale ale LCM-LC/MS și cuantifică numai nivelurile de medicamente solubile în ierarhia fluidului tisular extracelular, nu conținutul intracelular.

Am combinat pentru prima dată LCM și LC/MS pentru a cuantifica spațial antibioticele pe locul infecției cu tuberculoză. Metodologia este extrem de puternică, deoarece poate fi aplicată oricărui medicament cu molecule mici în orice stadiu al bolii. De fapt, am cuantificat recent un medicament antifungic candidat într-un model de șoareci de candidoză abdominală 14. Repartizarea diferențială a medicamentului în compartimente tumorale eterogene (inclusiv nuclei necrotici) este o preocupare principală în tratamentul cancerului și o zonă critică de cercetare privind descoperirea medicamentelor pentru cancer 15. LCM-LC/MS este potrivit pentru a răspunde acestor întrebări. În plus, LCM-LC/MS este util pentru descoperirea biomarkerilor pentru a cuantifica modificările metabolice, lipidomice și proteomice care apar în regiunile tisulare și populațiile celulare în timpul patogeniei bolii.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.