Descoperirea interacțiunilor proteice și caracterizarea funcției proteinelor folosind tehnologia HaloTag

rezumat

Tehnologia HaloTag este o tehnologie multifuncțională care a demonstrat un succes semnificativ în izolarea complexelor proteice mici și mari din celulele mamiferelor. Aici evidențiem avantajele acestei tehnologii în comparație cu alternativele existente și arătăm utilitatea acesteia pentru a studia numeroase aspecte ale funcției proteinelor în celulele eucariote.

Abstract

Introducere

Înțelegerea funcției celulare, răspunsul la stimuli și modificările stărilor de dezvoltare și/sau de boală este strâns legată de deplierea proteomului în aceste diferite stări dinamice 1,2. S-au făcut multe lucruri pentru a înțelege proteomul organismelor inferioare, dar având în vedere numărul de proteine ​​și toate interacțiunile posibile, acest lucru a devenit foarte dificil în tratarea proteomului uman 1, 3-7. Progresele în spectrometria de masă au permis în mare măsură capacitatea de a efectua aceste studii și aici prezentăm un avans suplimentar și semnificativ în dezvoltarea tehnologiei HaloTag atât pentru detectarea eficientă a complexelor proteice, cât și pentru caracterizarea funcțională a proteinelor umane din celulele de mamifere 8-10. Această tehnologie a fost demonstrată recent în mai multe studii ca fiind un factor critic în descoperirea unor interacțiuni importante, permițând o perspectivă asupra funcției proteinelor noi și înțelegerea bolii 11-13.

Aici vă prezentăm protocoale de derulare și imagistică aplicate la două proteine ​​terapeutice cheie, proteina bromodomeniu BRD4 și histon deacetilaza, HDAC1 17. Cu aceste exemple, am arătat interacțiunea cu partenerii așa cum era de așteptat prin spectrometrie de masă, activitate enzimatică după izolarea complexă pentru HDAC1 și localizarea celulară corectă pentru ambele. Împreună, aceste rezultate demonstrează natura multifuncțională și puterea tehnicii de caracterizare a interacțiunilor și funcției proteinelor eucariote.

Protocol

Notă: Următorul protocol poate fi utilizat cu orice HaloTag Fusion și în orice linie celulară la alegere transfectată stabil sau tranzitoriu. Pentru aceste exemple, oferim protocoale pentru transfecția tranzitorie a fuziunilor HaloTag în celule HEK293T sau HeLa. Pentru toate experimentele, vă recomandăm să utilizați numai controlul proteinelor.

1. Test de expresie a proteinelor de fuziune

3. Imagistica celulară a proteinelor de fuziune marcate fluorescent folosind un ligand permeabil citoplasmatic și nuclear

  1. Celule de transfecție, desemnare și imagine:
    1. Într-o lamelă de acoperire cu 8 godeuri pentru fiecare proteină de fuziune sau control, plătiți 400 μl de celule HeLa în mediul corespunzător din fiecare godeu la o densitate de 1-2 x 105 celule/ml.
    2. Se incubează 18-24 ore la 37 ° C și 5% CO 2, apoi se transfectează conform recomandărilor.
    3. 18-24 de ore după transfecție, diluați ligandul TMR 1: 200 în mediu celular adecvat, apoi adăugați 100 μl din această soluție în fiecare godeu și amestecați ușor.
    4. Incubați celulele transfectate care conțin liganzi timp de 15 minute la 37 ° C și 5% CO2.
    5. Se aspiră liganții mediului și se înlocuiește cu 500 μl de medii corespunzători care conțin liganzi lipsă de etichetă de fuziune proteică care au fost încălziți la 37 ° C
    6. Repetați de două ori pentru un total de trei spălări.
    7. Puneți celulele înapoi în incubator (376, C și 5% CO 2) timp de 30 de minute.
    8. Aspirați mediul și înlocuiți cu 500 μl de mediu adecvat care a fost încălzit la 37 ° C
    9. Imagine la microscop cu parametri de achiziție adecvați (excitație TMR: 555 nm, emisie: 585 nm).

Rezultate reprezentative

Când lucrați cu orice nouă proteină de fuziune, este important să testați mai întâi expresia proteinei după transfecție și, de asemenea, să confirmați că se produce o proteină cu greutatea moleculară corectă. Deoarece proteinele de fuziune HaloTag pot fi marcate fluorescent și covalent cu liganzi permeabili sau, în funcție de localizare, impermeabili, este posibil să se determine rapid expresia prin denaturarea lizatelor celulare prin electroforeză pe gel, urmată de o scanare pe fluorimager. Folosind secțiunea 1.2, imprimați Halo BRD4 (189 kD) și controlul HaloTag singur (Ctrl) observat (34 kD, 2A) protocolul descris. După cum sa menționat în protocol, expresia proteinelor de fuziune poate fi detectată și cu Western blot convenționale cu anticorpi anti-HaloTag sau, dacă sunt prezenți, anticorpi împotriva proteinei momeală. Dacă este posibil, se recomandă utilizarea ligandului fluorescent în loc, deoarece este mai precisă, mai rapidă și mai ușoară decât detectarea anticorpilor și, de asemenea, cantitativă 10.

Complexele izolate pot fi, de asemenea, examinate pentru activitate; Se recomandă eluarea complexelor cu protează TEV (secțiunea protocol 2.5), astfel încât acestea să păstreze funcționalități. În Figura 3A este arătată colorarea cu argint a gelului Halo-HDAC1 complexe derulante eliberate din rășină utilizând protează TEV. Ca o protează TEV, cantități semnificative de proteină momeală, în acest caz HDAC1, sunt observate într-o zonă de legătură între proteina de fuziune Tag și partenerul său de fuziune (Fig. 3A) a împărți. Pentru a determina dacă această fracțiune a activității HDAC1, probele TEV eluate au fost testate într-un test HDAC-Glo 21 luminiscent HDAC. Ca în 3B Așa cum se arată, probele cu afișaj HDAC1 au prezentat HDAC1 cu activitate ridicată (coloana 1), care a fost inhibată în mod specific cu un inhibitor HDAC cunoscut, SAHA 22 (coloana 2). Ca controale pentru a demonstra în continuare specificitatea, nu s-a observat nicio inhibiție HDAC cu un inhibitor al sirtuinei de familie înrudit, EX-527 22 (coloana 3) și nu a fost detectat niciun semnal numai cu tampon dat fără sonda HDAC1 (coloana 4).

O parte esențială a proteomicii funcționale și a înțelegerii complexelor este, de asemenea, înțelegerea localizării proteinelor și/sau a traficului de persoane. Deoarece aceste construcții de fuziune pot fi etichetate fluorescent în celule, am monitorizat localizarea lor utilizând imagini confocale. După protocolul din secțiunea 3, celulele HeLa au devenit tranzitorii cu Halo-BRD4 (4A) și Halo-HDAC1 (4B) transfectat marcat fluorescent cu ligandul TMR și imaginat. Ca în 4A și 4B prezentate localizate atât în ​​nucleu, cât era de așteptat 17. Aceste date indică faptul că prezența Tag nu a modificat localizarea celulară fiziologică a partenerului de fuziune.

interacțiunilor
Figura 1. Schema derulării proteinei și a aplicațiilor imagistice confocale. Folosirea acestuia ca construcție ingle este posibilă mai multe aplicații pentru înțelegerea funcției proteinelor în celulele de mamifere. Pentru toți, un construct de fuziune a halo este exprimat stabil sau tranzitoriu în celule de mamifere aderente sau în suspensie. Pentru derulările complexelor proteice, celulele sunt lizate, complexe captate covalent pe rășină și eluate fie prin eluție SDS (banda stângă), fie prin decolteare TEV (cale dreaptă). Eluția SDS este recomandată pentru a continua analiza spectrometriei de masă, în timp ce digestia TEV este optimă pentru efectuarea analizei funcționale. Pentru a caracteriza expresia, localizarea celulară, evenimentele de trafic de persoane sau transformarea proteinelor, celulele vii, proteinele de fuziune etichetate fluorescent și analizate în continuare pe geluri SDS-PAGE sau prin intermediul imaginii confocale. Sunt disponibili ambii liganzi fluorescenți celulari sau opaci, în funcție de localizarea sau reprezentarea proteinei de fuziune în celulă.

ild 2 "fo: content-width =" 6in "src ="/files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>Figura 2. Expresia proteinei Halo-BRD4, analiza de tragere și spectrometrie de masă. (A) Un gel SDS-PAGE care arată expresia proteinei de fuziune Halo-BRD4, 189 kD și proteine ​​de fuziune Halo-tag singur, 34 kD, control (Ctrl) într-un lizat de celule HEK293T cu ligand TMR (secțiunea de protocol 2.1). Gelurile au fost scanate cu fluorimager pentru detectare și s-a folosit un marker fluorescent de greutate moleculară. (B) Gelurile de colorare a argintului eluate din replicile biologice pentru derulările din probele Halo-BRD4 și Ctrl cu SDS. Dimensiunile greutății moleculare pentru numerele spectrale ale gelului (stânga) și valorile factorilor de abundență spectrală normalizată (NSAF) (dreapta), care reprezintă greutățile moleculare ale proteinelor proteine ​​identificate în analiza spectrometriei de masă a replicilor biologice Halo. (C) BRD4 și Ctrl. Sunt prezentate proteinele despre care se știe că interacționează cu BRD4, inclusiv componentele pTEFb (CDK9 și Cyclin T) 18.20 și BRD9 19. Nu au fost identificate peptide din aceste proteine ​​în Ctrl.

proteice
Figura 3. Izolarea complexului Halo-HDAC1 și analiza activității. (A) Geluri colorate cu argint care arată izolarea complexelor Halo-HDAC1 și a fundalului de la Ctrl după decolteul TEV (Secțiunea Protocol 2.5). Banda proeminentă HDAC1 (55 kDa) și banda de protează TEV sunt marcate. HDAC1 gratuit este optimizat prin decolteul TEV într-un linker între secvența de fuziune HaloTag și HDAC1 după includerea pe rășină (Ilustrația 1). (B) Graficul prezintă activitatea eșantioanelor de izolații complexe HDAC1 într-un test de histonă deacetilază luminescentă generată de HDAC Glo 21. Coloana 1 a graficului prezintă niveluri ridicate de activitate HDAC cu probele de derulare Halo-HDAC1 (HDAC1). Coloana 2 arată că această activitate poate fi scăzută în mod specific prin adăugarea inhibitorului HDAC, SAHA 22, la probele de tip HDAC1 care se trag în jos. Ca martori, coloana 3 prezintă un inhibitor de deacetilază specific pentru familia sirtuinei, dar nu inhibă HDAC-urile, EX-527 22, nu inhibă activitatea HDAC1 și coloana 4, nu se observă activitate cu tamponul singur.

proteice
4. Imagini confocale Halo-BRD4 și Halo-HDAC1. Imaginea confocală a celulelor vii a celulelor HeLa cu Halo-BRD4 (A) sau Halo-HDAC1 (B) transfectat cu liganzi marcați fluorescent. (A) Expresia Halo-BRD4 limitată la nucleu și (B) Expresiile Halo-HDAC1 predominant nucleare. Partea stângă a panoului canalului fluorescent și dreapta este o suprapunere a canalului fluorescent cu canalul pentru fiecare DIC. Imaginile au fost obținute folosind un microscop confocal echipat cu o cameră climatică de 37 ° C + CO 2 cu seturi de filtrare adecvate. Bara de scalare = 20 µm.

Discuţie

Odată ce proteinele de fuziune sunt gata pentru experimentele derulante, pentru a obține succesul maxim cu protocolul, este foarte important să respectați intervalele de timp recomandate în secțiunile de liză, legare și spălare, deoarece unul dintre cele mai mari avantaje este viteza izolării complexe Proces. Dacă oricare dintre acești pași se prelungește în timp, așa cum este necesar pentru o procedură de detectare bazată pe anticorpi, există riscul de disociere complexă sau de legare nespecifică crescută 8. La fel, dacă timpii din timpul lizei celulare sau legării sunt scurtate celulele nu sunt complet lizate sau capturate eficient sau capturate. Dacă numărul de spălări este redus sau o bună amestecare a rășinii nu are loc în legare sau spălare, atunci nivelurile de fond ale proteinelor nespecifice sunt crescute. În plus, mijloacele de liză sunt foarte importante deoarece se referă la afinitatea de legare pentru rășină. Încearcă sonicizarea probelor, îndepărtarea agentului de curățare recomandat, adăugarea de SDS sau alți agenți de curățare puternici și/sau pe care inhibitorul de protează AEBSF îl va reduce sau va duce la pierderea legării proteinelor de fuziune și a complexelor acestora de rășină.

După cum sa menționat în introducere, progresele semnificative în proteomică au fost activate de progrese semnificative în spectrometria de masă 1,7. Prin urmare, este important să se sublinieze parametrii importanți ai alegerii analizei spectrometriei de masă pentru a deconvoluia amestecul de proteine ​​obținut în derulări. Instrumentele trebuie să fie robuste și capabile să analizeze în mod regulat și eficient probele care conțin o cantitate mică de proteine, adesea mai mică de 23.24. Cu tehnologia HaloTag, se poate utiliza o abordare multifuncțională, promovând studiile ProteomICs și obținând o mai bună înțelegere a funcției proteinelor din celulele mamiferelor.

Dezvăluiri

Costurile de publicare pentru acest articol sunt sponsorizate de Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy și Marjeta Urh sunt angajați ai Promega Corporation, proprietari comerciali prin atribuirea brevetelor pentru tehnologia HaloTag și aplicațiile sale. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama și David Allen sunt angajați ai MSBioworks, serviciile de spectrometrie de masă descrise în acest manuscris.

Mulțumiri

Mulțumim Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley și Dr. Keith Wood pentru susținerea acestei lucrări și Dr. James Cali pentru citirea critică a manuscrisului. DLD, JM, HB, NM, AN, JC și MU sunt angajați ai Promega Corporation. MF, RJ, RA și DA sunt angajați ai MS Bioworks, LLC.