Diferențierea rolurilor funcționale ale expresiei genei de celulele imune și neimune la șoarece

rezumat

Transplantul de măduvă osoasă oferă o modalitate de a schimba genotipul celulelor derivate din măduva osoasă. Dacă gena de interes este exprimată atât pe celulele derivate din măduva osoasă, cât și pe celulele derivate din măduva osoasă, transplantul de măduvă osoasă poate schimba celulele derivate din măduva osoasă într-un genotip diferit fără a genotipa celulele non-derivate din măduva osoasă.

Abstract

Protocol

A. Înainte de a începe considerații tehnice

* O scurtă descriere a protocolului de testare se află în ilustrația 1 afișate.

2. Iradierea șoarecilor receptor

Șoarecii sunt crescuți și păstrați într-un dispozitiv patogen. Așezați șoareci în plăcintă cu iradiere autoclavată cu filtre. Puneți un mouse în fiecare slot al plăcii de iradiere. Puneți tortul în lumina reflectoarelor și asigurați-vă că masa rotativă și tortul se întorc.
Porniți pompa de aer pentru ventilație. Închideți ușa încălzitorului și blocați-o.
Iradiați șoarecii cu 1000 rad (care este echivalent cu 10 Gy) timp de aproximativ 10 minute (în funcție de sursa de radiație și timpul de înjumătățire). Din acest moment, șoarecii iradiați sunt imunocompromiși și au o imunitate slabă la infecție. După iradiere, scoateți tortul și puneți-l într-un recipient steril pentru transport la dulapul pentru biosecuritatea animalelor. Evitați să dați șoarecilor un mediu extern pentru a minimiza șansele de infecție.
În dulapul pentru biosecuritate, transferați șoarecii în cuști de șoareci autoclavate cu paturi autoclavate (4 șoareci pe cușcă. Apă sterilă nouă cu suspensie de sulfatrim - 3,12 ml la 100 ml de apă).
Înfășurați sticla de apă cu folie de aluminiu, deoarece antibioticele sunt sensibile la lumină. Agitați bine sticla de sulfatrim cu amestec înainte de ao pune în cușcă.

3. Extracția măduvei osoase a donatorului

4. Numărarea celulelor donatoare de măduvă osoasă

Adăugați 100 μl de albastru tripan într-un tub Eppendorf și 100 μl suspensie de măduvă osoasă într-un tub Eppendorf și amestecați. Pipetați amestecul de celule colorate pe o cameră de numărare.
Cantitatea de celule este calculată din suprafața totală de viață a numărului de celule ale măduvei osoase în tubul Falcon = numărul de celule nepătate în 16 pătrate x 2 (datorită diluției în albastru tripan) x 10.000 x 50 ml
Centrifugați celulele măduvei osoase în tuburi Falcon de 50 ml la 2.000 rpm timp de 5 minute la 4 ° C.
Îndepărtați supernatantul. Pe baza numărului total de celule, redimensionați peleta cu PBS la 1 x 108 celule pe ml

5. Infuzie de șoareci primiți

Încălziți șoarecii destinatari pe un tampon de încălzire și sub o lampă de căldură. Așezați șoarecii destinatari în suport. 1 × 107 celule pe șoarece în 100-200 μl intravenos.
Injectarea măduvei osoase a donatorului trebuie făcută între 4-24 de ore după iradiere.
Lipiți la 4 șoareci injectați pe cușcă. Mențineți șoarecii primitori injectați în cuști autoclavate cu apă tratată cu antibiotice pentru primele 4 săptămâni în creșterea animalelor fără patogeni și lăsați șoarecii să recâștige imunitatea. Schimbați cuștile, apa tratată cu antibiotice și alimentele la fiecare 4 zile pentru a menține igiena.

6. Inducerea colitei și evaluarea colitei

7. Inspecția calității transplantului de măduvă osoasă utilizând citometria în flux

Etichetați fiecare tub de probă de sânge sau măduvă osoasă # 1-5:
Pregătiți amestecul de anticorpi pentru fiecare tub respectiv în întuneric.

# 1 Fără anticorpi
# 2 30 µl control izotip FITC + 30 µl control izotip PE + 15 µl blocare CD16/32
# 3 30 µl FITC CD45.1 Ab + 15 µl CD16/32 blocare
# 4 30 µl PECD45.2 Ab + 15 µl CD16/32 blocare
# 5 30 µl FITC CD45.1 Ab + 30 µl PE CD45.2 Ab + 15 µl blocare CD16/32

Nu adăugați nimic la proba de sânge sau măduvă osoasă # 1

Adăugați 5 μl de amestec de anticorpi nr. 2 la fiecare probă de sânge sau măduvă osoasă nr. 2

Adăugați 3 μl de amestec de anticorpi # 3 la fiecare probă de sânge sau măduvă osoasă # 3

Adăugați 3 μl de amestec de anticorpi # 4 la fiecare probă de sânge sau măduvă osoasă # 4

Adăugați 5 μl de amestec de anticorpi # 5 la fiecare probă de sânge sau măduvă osoasă # 5

Păstrați în întuneric în gheață timp de 30 de minute.
2 ml de tampon de liză RBC 1X în fiecare tub. A se păstra la întuneric pe gheață timp de 15 minute.
Centrifugați celulele la 1500 rpm, 5 min la 4 ° C. (rotor GH 3,8, 1500 rpm = 350 xg) Îndepărtați supernatantul. Peleta cu 500 μl de tampon de colorare a celulei în întuneric, apoi vortexează scurt.
Verificați CD45.1 (echivalent cu WT) și CD45.2 (KO) în probele de sânge și măduvă osoasă imunotratate folosind citometrie de flux. Selectați FITC pentru a reprezenta WT CD45.1 și PE pentru KO CD45.2.
Analizați rezultatele citometriei de flux utilizând software-ul FlowJo. Calculați raportul dintre raportul FITC: PE sau raportul PE: FITC pentru a determina dacă genotipurile genotipului donatorului dominante în sânge și măduva osoasă.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Dacă gena de interes joacă un rol semnificativ în celulele imune în dezvoltarea colitei, șoarecii care primesc măduvă osoasă de genotip diferit prin transplant de măduvă osoasă (WT KO sau KO la WT) ar trebui să aibă un răspuns modificat la colita DSS. Unul dintre cei mai importanți parametri în determinarea severității colitei este colorarea H&E a țesuturilor colonului. Modificările structurii țesutului colonului și semnele inflamației pot fi evaluate cantitativ prin sistemul de evaluare a histologiei H&E. Criteriile pentru evaluarea histologiei H&E pentru modelul DSS pentru colită pot fi găsite aici 2. Alternativ, colita indusă chimic poate fi, de asemenea, indusă de acidul trinitrobenzenesulfonic (TNBS). Metodele de inducere a colitei TNBS și criteriile de evaluare a histologiei H&E pot fi găsite într-o publicație anterioară 3. Diferența de scor histologic între grupurile analizate de testele t ale elevilor.

Șoarecii pot fi colita semnificativ supra-îmbunătățită sau agravată la șoareci cu transplant de măduvă osoasă falsă (WT WT sau KO KO). Dacă gena de interes joacă un rol semnificativ în colită prin intermediul celulelor derivate din măduva osoasă, șoarecii cu măduvă osoasă schimbată ar trebui să răspundă semnificativ diferit față de șoarecii cu transplant de măduvă osoasă falsă.

Pentru modelul colitei DSS, modificarea histologiei poate fi evaluată prin scorul histologic (vezi pct Figura 4). Modificarea semnificativă a scorului histologic se poate datora formării colitei mediată de gena de interes în celulele derivate din măduva osoasă. De exemplu, catelizidina este o genă peptidă antimicrobiană și antiinflamatoare (genă de interes în cazul nostru) 4. Fără transplanturi de măduvă osoasă, șoarecii knock-out catelicidin au dezvoltat de obicei colită mai rea decât șoarecii de tip sălbatic ca răspuns la DSS. Transfuzia șoarecilor catelicidin knockout (KO) de măduvă osoasă de tip sălbatic (KO) duce la colită ameliorată, în timp ce transfuzia măduvei osoase de la șoareci catelicidin knockout (KO) la șoareci de tip sălbatic (WT) duce la colită agravată atunci când DSS (Figura 2) expus.

Pentru a confirma expresia genei de interes, expresia ARNm a genei de interes (de exemplu, catelizidina) de la măduva osoasă donatoare de tip sălbatic în țesutul de colon (sau alt tip) de șoareci care au primit knockout cu deficit de catelizidină, după transplantul de măduvă osoasă, ar trebui să fie detectabilă. De asemenea, este interesant să știm dacă expresia genei de interes la șoarecii primitori de tip sălbatic a redus măduva osoasă după donarea de la șoareci knockout.

Transplantul de măduvă osoasă cu succes al donatorului este reprezentat de raportul dominant al izotipului CD al donatorului față de izotipul CD al receptorului atât în celulele sanguine periferice, cât și în măduva osoasă a șoarecilor primitori. Măduva osoasă arată cel mai bine etichetarea CD45.1 și CD45.2 în citometrie în flux, deoarece sângele are o mulțime de celule nepătate (Figura 2 și 3).

Figura 1. Protocolul experimental de transplant de măduvă osoasă.

Figura 2. Datele de citometrie în flux pentru șoarecii primitori ai măduvei osoase după transplant de măduvă osoasă. Axa Y arată semnalul CD45.1 etichetat FITC, iar axa X arată semnalul CD45.2 etichetat PE. Grefarea osoasă de succes este definită de modificarea genotipului CD45.1 sau CD45.2 atât în măduva osoasă, cât și în sângele șoarecilor primitori. Faceți clic aici pentru a vedea o imagine mai mare .

Figura 3. Date de citometrie în flux de la șoareci de sânge primitori după transplant de măduvă osoasă. Axa Y arată semnalul CD45.1 etichetat FITC, iar axa X arată semnalul CD45.2 etichetat PE. Grefarea osoasă cu succes este definită de modificarea genotipului CD45.1 sau CD45.2 atât în măduva osoasă, cât și în sângele șoarecilor primitori. Faceți clic aici pentru a vedea o imagine mai mare .

Figura 4. Evaluarea colitei la șoareci după transplant de măduvă osoasă. (A) Exemplu de imagini H&E ale colonilor datorită histologiei normale și colitei DSS. (B) Scoruri histologice. Inducerea cu succes a colitei DSS poate fi confirmată prin creșterea semnificativă a scorului histologic până în ziua 5 a tratamentului DSS. După schimbarea măduvei osoase la genotip diferit, scorul histologic ar trebui să se schimbe semnificativ. Acest lucru sugerează evoluția modificării colitei cauzată de exprimarea genei de interes în celulele derivate din măduva osoasă. Datele sunt reprezentate ca medie ± deviație standard a mediei.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Această abordare a transplantului de măduvă osoasă este potrivită pentru cercetarea imunologică a colitei, infecțiilor, cancerului, obezității și a altor boli. Acest experiment de transplant de măduvă osoasă este necesar atunci când gena de interes este exprimată atât în celulele derivate din măduva osoasă, cât și în cele non-derivate din măduva osoasă și se suspectează că gena de interes mediază boala de către celulele din ambele populații. De exemplu, se arată că peptida antimicrobiană catelizidină modulează colita acută. Dar este exprimat atât în celulele epiteliale, cât și în celulele imune (macrofage). Apoi avem grefe osoase pentru a defini care populație de celule modulează colita acută la șoareci. Severitatea colitei a fost modificată semnificativ după modificarea genotipului catelizidinei măduvei osoase prin transplantul de măduvă osoasă. Apoi putem concluziona că catelizidina exprimată în celulele derivate din măduva osoasă joacă un rol semnificativ în modularea colitei acute ca răspuns la DSS.

Pe de altă parte, există multe modalități de a urmări succesul transplantului de măduvă osoasă. Analiza prin citometrie în flux a genotipurilor CD45.1 și CD45.2 poate fi o metodă cantitativă pentru a determina proporția de celule stem donatoare derivate din măduva osoasă la șoarecii primitori. Celulele derivate din măduva osoasă pot fi diferențiate în mai multe tipuri de celule 10. Dacă analiza citometriei în flux nu este posibilă, este posibil să se utilizeze șoareci donatori masculi (cromozom XY) și șoareci femela (cromozom XX) 11. Șoarecii donatori poartă cromozomi Y unici în corpul șoarecilor femele primitori XX. Cromozomul Y poate fi identificat prin fluorescență hibridizare in situ 11. În plus, imunohistochimia CD45.1, CD45.2 și/sau gena de interes în țesuturi poate fi necesară pentru a vizualiza celulele donatoare derivate din măduva osoasă.

Dar analiza citometrică în flux CD45 și procedurile de hibridizare in situ ale cromozomului Y sunt de obicei efectuate după ce șoarecii sunt uciși. Pentru a monitoriza poziția celulelor donatoare la șoarecii primitori utilizați pentru a monitoriza bolile cronice, cum ar fi cancerul, fără ca șoarecii să fie examinați, este posibil să se utilizeze șoareci transgenici cu proteină fluorescentă verde ca șoareci donatori 12. Prin urmare, celulele derivate din celula osoasă donatoare pot fi urmărite în corpul șoarecilor primitori utilizând imagini optice non-invazive de înaltă rezoluție sub anestezie tranzitorie și acest lucru se poate face în mod repetat.

Nu toți șoarecii au transplanturi de măduvă osoasă de succes 13. Am observat,

10-20% dintre șoareci mor de anemie sau infecție în primele 2 săptămâni după iradiere. Prin urmare, la începutul experimentului ar trebui să se facă mai mulți șoareci decât este necesar. De exemplu, ar trebui să pregătiți 10 șoareci pe grup la începutul experimentului, dacă vă așteptați la 8 șoareci pe grup până la sfârșitul experimentului colitei. Deci, asigurați-vă că îndepărtați șoarecii morți cât mai curând posibil. Rata reconstituirii imune este corelată cu numărul de celule stem hematopoietice din măduva osoasă perfuzate la șoarecii primitori 14. Prin urmare, este esențial să existe un număr suficient de celule vii de măduvă osoasă (1 x 107 celule per șoarece) infuzate la șoareci destinatari pentru transplantul de măduvă osoasă cu succes.

Șoarecii beneficiari după iradiere au fost compromise de imunitate. Procedurile de disecție a șoarecilor donatori și de preparare a măduvei osoase trebuie efectuate în același standard ca și experimentele de cultură celulară. Condițiile aseptice trebuie aplicate folosind instrumente și recipiente sterile. În toate experimentele, PBS conține 1% penicilină-streptomicină și 10 U/ml heparină trebuie utilizată la manipularea oaselor de tărtăcuță de grădină. Toți reactivii sunt pentru cultura celulară. Discuții tehnice suplimentare pot fi găsite în referința 13.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Nu s-au declarat conflicte de interese.

Mulțumiri

Această lucrare a fost finanțată printr-un grant pilot pentru studiul de fezabilitate de la Centrul UCLA-CURE, Premiul pentru Dezvoltarea Carierei Fundației Croite a Bolii și Colitei din America (# 2691) și finanțarea Institutului Național de Sănătate NIDDK K01 (DK084256) pentru Hon Wai Koon.

Chirurgia de iradiere a măduvei osoase a fost susținută de Bernard Levin și Scott Kitchen de la UCLA Center for AIDS Research Mouse/Human Chimera Core Facility. Operația de citometrie în flux a fost susținută de facilitatea Vector Core a UCLA.