Efecte celulare, mecanisme de acțiune și metode de detectare a hormonilor tiroidieni și a acestora

Efecte celulare, mecanisme de acțiune și metode de detectare a hormonilor tiroidieni și a metaboliților acestora Disertație pentru obținerea diplomei universitare doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) În biologie prezentată la Facultatea de Științe ale Vieții a Universității Humboldt din Berlin de către trofologul Ina Lehmphul, președinte al Universitatea Humboldt din Berlin Prof. Dr. Jan Hendrik Olbertz Decan al Facultății de Științe ale Vieții Prof. Dr. Richard Lucius Recenzant: 1. Prof. Dr. Werner Kloas 2. Prof. Dr. Josef Köhrle 3. Prof. Dr. Jens Mittag Ziua examenului oral: 23 mai 2015

mecanisme

Cuprins Cuprins. I Lista abrevierilor. V Lista figurilor. X Lista tabelelor. XI rezumat. XII abstract. XIII 1. Introducere. 1 1.1 Tiroida. 1 1.2 Hormoni tiroidieni (TH). 1 1.2.1 Biosinteza. 1 1.2.2 Eliberare și transport. 3 1.3 Axa tiroidiană hipofizară hipotalamus (HPT). 4 1.4 Metabolismul hormonului tiroidian. 4 1.4.1 Metabolismul hormonului tiroidian prin deiodaze. 4 1.4.2 Metabolism TH alternativ. 6 1.4.3 Efecte locale și sistemice ale TH T 3. 7 1.5 Metaboliți TH importanți 3.5 T. 9 2 1.5.1 Efecte locale și sistemice ale 3.5 T 2. 9 1.5.2 Transportul în ser și în celulele țintă . 10 1.5.3 Receptorii metabolitului TH. 10 1.5.4 Metode de detectare pentru 3,5 T 2. 11 1,6 Metaboliți TH importanți 3 T AM. 12 1 1.6.1 Efecte locale și sistemice ale 3 T 1 AM. 12 1.6.2 Transportul în ser și în celula țintă. 13 1.6.3 Receptorii metabolitului TH. 13 1.6.4 Metode de detectare a metabolitului. 14 1.7 Metaboliți TH importanți TA 1 3 Acid tiroacetic. 14 2. Obiectivul lucrării. 17 2.1 Metoda de detectare a metaboliților hormonilor tiroidieni. 17 2.2 Efectul metaboliților hormonului tiroidian în modelul culturii celulare. 17 3. Material. 18 3.1 Produse chimice. 18 3.2 Dispozitive. 18 I.

3.3 Consumabile. 18 3.3.1 Kituri de reactivi. 18 3.3.2 Tampoane și soluții. 19 3.4 Baze de date. 20 3.5 Software. 20 4. Metode. 23 4.1 Metode biologice moleculare. 23 4.1.1 Izolarea ARN-ului cu Trizol. 23 4.1.2 sinteza cdna. 23 4.1.3 qpcr. 24 4.1.4 Grunduri. 25 4.2 Metode biochimice ale proteinelor. 28 4.2.1 Principiul Bradford. 28 4.2.2 Implementarea Bradford. 28 4.3 Cultura celulară. 29 4.3.1 Linia celulară pancreatică MIN6. 29 4.3.2 Linia celulară hepatocelulară HepG2 umană. 29 4.4 Citotoxicitate/teste de viabilitate celulară. 29 4.4.1 Test MTT Test de toxicitate celulară dependentă de NADPH. 29 4.4.1 a) Principiul testului. 29 4.4.1 b) Implementare. 30 4.4.2 Analiza viabilității celulei ATP. 30 4.4.2 a) Principiul testului. 30 4.4.2 b) Implementare. 30 4.5 Captarea celulară/legarea suprafeței celulare a 3 T 1 AM. 30 4.6 Extragerea celulelor MIN6 pentru analiza LC MS/MS. 31 4.7 Extracția supernatantelor de cultură celulară MIN6 pentru analiza LC MS/MS. 32 4.8 Parametrii LC MS/MS. 32 4.8.1 Analiza AbSciex 4000 a lizatelor celulare de cultură celulară. 32 4.8.2 Analiza AbSciex 6500 a supernatantelor de cultură celulară. 34 4.9 Secreția de insulină stimulată de glucoză (GSIS). 36 4.10 Analiza volumului de energie specific substratului cu Seahorse XF Bioanalyzer. 36 4.10.1 Principiul măsurării. 36 4.10.1 a) Respirație mitocondrială. 37 4.10.1 b) Glicoliză/metabolismul substratului. 39 II

Lista abrevierilor C grade Celsius µ micro µg micrograme µl microlitru µm micromolar 2 DG 2 dezoxiglucoză 3 T 1 AM 3 iodotironamină AADC aromatic L aminoacid decarboxilază Fig. Figura AC adenilat ciclază Adra 2α receptor adrenergic 2alfa ANO1 anoctamină 1 AOp amin oxid Indicele de masă BSA ser albumină cdna ADN complementar CLIA Chemilumineszenez Imunoanaliză Ct ciclu de treshhold COX Citocrom C Oxidază DC Decarboxilază Dehal Dehalogenază DEPC Dietilpirocarbonat Dio Deiodază DIT 3,5 Diiodtirozină DMEM Dubelcco anhidroxilDoxicol anhidroxid de sodiu Dual Oxidase ECAR Rata de acidificare extracelulară V

EDC ELISA ERK EST FBS FCCP Etil 3 (3 dimetilaminopropil) carbodiimidă enzimatică legată de imunoenzimă kinază reglată extracelulară exprimată secvență etichete fetal bovin ser carbonil cianură p trifluorometoxifenilhidrazonă ft 3/ft 4 liber/neproteinat legat T 3/T 4 GPLC fwD g h H 2 OH 2 O 2 HbA 1 c HPLC HPRT HPT ax HRP icv Ig i.p. Ipro i.v. kda KRBH Lat/LAT LCB LC/MS LDL m M mab performanță rapidă cromatografie de lichide inainte Acceleration anti IgG de șoarece, specific Fc și biotinilate receptor-glucoza stimulata secreția de insulină de hidrogen apă oră cuplat cu proteina G peroxid glicohemoglobinei lichidă de înaltă performanță cromatografie de hipoxantin guanin fosforibozil glandă hipoxantina guanophosphoric oxid hipoxantina hipofizară ventricul hipofizară ventricul hipofizară ventriculara oxid hipofizară glandular ventricul tiroidian glandular axa meracophageal llobulin iperoniazid intraperitoneal intravenos kilodalton Krebs Ringer tampon HEPES transportor de aminoacizi tip L tampon încrucișat cromatografie lichidă cuplat tandem spectrometrie de masă lipoproteină cu densitate mică milar monoclonal anticorp VI

MAPK Mct/MCT min MIN6 CU MTT mrna n NA NADH NADPH NaN 3 ND NEAA ng NIS nm nm NQ ns Ntcp/NTCP NTI Oatp/OATP OCR ON p pab PAI PB PBS PBST PCR PI3K POAF qpcr Transport proteină kinază activată cu mitogen β monocarbox Linie celulară șoarece 3 monoiodo tirozină tetrazolium sare messengerrna nano neanalizată nicotinamidă adenină dinucleotidă nicotinamidă adenină dinucleotid fosfat azid de sodiu nedetectat aminoacizi neesențiali nanogramă iodură de sodiu simporter nanometru nanomolar nu cuantificat oxigenat fosfat de oxigen Soluție salină Soluție salină tamponată cu fosfat cu reacție în lanț a polimerazei Tween Fosfatidil inozitol 3 kinază postoperatorie fibrilație atrială (inimă) cantitativă în timp real PCR VII

rev RIA RNA rpm RQ rt 3 s.c. SD SDS sec SHIP Slc/SLC SULT T 0 T 1 T 2 T 3 T 4 TA TAE TAM TAAR TBG TCA Tg TH TBME TPO TRα TRβ TRE TRH TSH radioimunologie inversă revoluții ale acidului ribonucleic/minim coeficient respirator invers 3,3,5 triiod L tironină tiroid subcutanat sodiu dodecil sulfat al doilea studiu al sănătății în Pomerania solut purtător sulfotransferază tironină 3/3 tironină 3,5/3,3/3,5 diodină L tironină 3,3,5 triiodină L tironină 3,3,5,5 tetraiodină L tironină/Tiroxină acid tiracetic tris acetat EDTA tampon tironamină urină amină receptor asociat tiroxină legare globulină acid tricarboxilic tiroglobulină tironină, hormon tiroidian terț butil metil eter tiroperoxidază receptor hormon tiroidian receptor alfa hormon tiroidian 4 eliberare de proteină proteină 4 Transtiretina VIII

VLDL vol% lipoproteine ​​cu densitate foarte mică vol% IX

Mecanismul de transport în celula țintă este cunoscut și activarea receptorilor de membrană plană nu a fost încă investigată. 16

Tabelul 2 Kituri de reactivi utilizate în mod obișnuit Kit de reactivi qpcr absolut SYBR Green Mix Bio Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay RQ1 RNase free DNAse ImmunoPure MAb isotyping Kit Insulin (mouse) ultrasensitive ELISA iscript Select cdna synthesis kit LowCross Buffer Kit de testare proteine ​​PIERCE EZ Link Plus Peroxidază activată PIERCE SuperSignal ELISA Femto Substrat de sensibilitate maximă RIA rt 3 Sepharose r Protein A Slide A Lyzer Dializ Casete 2K MWCO ThermoScript Reverse Transcriptase Trizol Producător Abgene (Epsom, Marea Britanie) Bio Rad Laboratories (München) Promega WI, SUA) Promega (Madison, WI, SUA) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, SUA) Diagnosticul DRG (Marburg) Bio Rad (München) Biosciences Candor (Wangen) Thermo Scientific (Waltham, MA, SUA) Thermo Scientific ( Waltham, MA, SUA) Thermo Scientific (Waltham, MA, SUA) ZenTech SA (Belgia) GE Healthcare (Freiburg) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, SUA) Invitrogen (Karlsruhe) Thermo Scientific (Waltham, MA, SUA) 3.4 Baze de date Tabelul 4 prezintă toate sistemele de gestionare a datelor utilizate. 3.5 Software Tabelul 5 rezumă software-ul utilizat în această lucrare. 20