Efectul galatului de epigalocatechină al cateinei de ceai asupra metabolismului energetic al șoarecelui - PDF gratuit

Institutul German pentru Cercetarea Nutriției (DIfE) Potsdam - Rehbrücke, Departamentul de Farmacologie Grupul de lucru Fiziologia Metabolismului Energetic Efectul ceaiului catehină epigalocatechină galat asupra metabolismului energetic al șoarecelui Disertație pentru obținerea titlului de doctor (Dr. rer.nat.) La Facultatea de Matematică și Științe Naturale a Universității din Potsdam de la Diploma .-Știința nutrițională Maika Friedrich născută 1 noiembrie 1978, Magdeburg Potsdam, februarie 2010

Această lucrare este licențiată în baza unui acord de licență Creative Commons: Atribuire Fără utilizare comercială Fără adaptare 3.0 Germania Pentru a vizualiza termenii licenței, vă rugăm să urmați hyperlinkul: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/Publicat online pe serverul de publicare al Universității din Potsdam: URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2010/4815/ URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159 http: // nbn-resolving .org/urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159

MRP NaOH NEFA RMN pa PAS PC PCR PDB PDE PDHx PEPCK PIG-B PK messenger Acid ribonucleic Rezistență la mai multe medicamente Proteine Hidroxid de sodiu Acizi grași neesterifiați Acizi grași neesterificați Rezonanță magnetică nucleară Postabsorptiv Acidul periodic Lichidul PIFC Acidul periodic Acidul periodic Schiff Acidul periodic Schiff Complex piruvat dehidrogenază Fosoenolpiruvat carboxilază Fenol-izoamil alcool-guanidiniu izotiocianat- mercaptoetanol Piruvat kinază PLA 2 Fosfolipază A 2 Plin Perilipin PO Palmitat oxidare pp postprandial Peroxisom timp-reactiv PC-reactiv oxigen-reactiv-timp-reactiv PC-reactiv-oxigen-reactiv-oxigen-reactiv Carboxilază SD Dieta standard SGLT1 Transportor glucozic dependent de sodiu 1 SO oxidare substrat StK Cușcă metabolică TG Trigliceridă TM substanță uscată UCP proteine de decuplare VO 2 Consum de oxigen WAT țesut adipos alb OMS Organizația Mondială a Sănătății VII

Introducere Polifenolii sunt flavonoizii, care la rândul lor sunt împărțiți în flavanoli și catechine. Catechinele din ceaiul verde reprezintă până la 30% din substanța uscată. Acestea sunt diferențiate după cum urmează: (Fig. 1-2): epicatechin (EC), epicatechin gallate (ECG), epigallocatechin (EGC) și epigallocatechin gallate (EGCG). Diferențele structurale apar în numărul grupărilor hidroxil și în prezența grupării galoil. Cu o pondere de până la 50% din conținutul total de catehină, EGCG este catehina predominantă în ceaiul verde. Pe lângă catehine, ceaiul verde conține proteine (15%), fibre (26%), alți carbohidrați (7%), lipide (7%), minerale (5%), aminoacizi (4%) și pigmenți (2%) (Cabrera și colab., 2006). Fig. 1-2: Structura chimică a principalelor ingrediente ale ceaiului verde (Koo & Noh, 2007) O altă componentă a ceaiului verde este cofeina, care reprezintă aproximativ 3 6% (Yang și Landau, 2000). O ceașcă de ceai verde conține între 20 și 100 mg EGCG și 20 40 mg cofeină (Stangl și colab., 2006; Khokhar și Magnusdottir, 2002). Diferitele catehine de ceai au activitate biologică diferită, EGCG prezentând cea mai mare activitate (Chen și colab., 1997). Dintre catechinele de ceai, are cel mai mare număr de grupări hidroxil de pe cele trei inele de carbon, care sunt importante pentru formarea compușilor de hidrogen. Grupa galoil conținută în molecula EGCG poate interacționa și cu alte molecule, de ex. B. Introduceți radicalii (Liao, 2001). 14

În introducere, a existat un interes deosebit în investigarea polifenolului EGCG, care se găsește predominant în ceaiul verde. Multe dintre efectele descrise în literatură au fost observate după utilizarea pe termen lung. Nu este clar dacă modificările studiilor pe termen lung sunt cauzate direct de EGCG sau indirect ca urmare a reducerii grăsimilor. Pentru investigațiile efectuate aici, a fost selectată, așadar, o durată scurtă sau medie a cererii, în care modificările în compoziția corpului nu au fost încă manifestate în mod clar. Scopul acestei lucrări a fost de a investiga în detaliu influența polifenolului de ceai EGCG asupra energiei și a metabolismului substratului după aplicarea pe termen scurt și mediu. Șoarecele a fost ales ca model de studiu deoarece acesta și oamenii sunt destul de asemănători în ceea ce privește biodisponibilitatea EGCG. Scopul a fost de a afla ce influență EGCG are asupra diferiților parametri fiziologici în modelul mouse-ului după aplicarea pe termen scurt și mediu. Metabolizarea energiei și a grăsimilor după aplicarea pe termen scurt și mediu ar trebui examinată în ceea ce privește echilibrul energetic și la nivel molecular, pentru a descoperi posibile mecanisme. 23

Material și metode Tab. 2-2: Surse nutritive ale dietelor semi-sintetice bogate în grăsimi Ingrediente [g/100 g] Experiment 3 (vezi 2.2.3.3) Experiment 4 (vezi 2.2.3.4) Caseină 1 20 18 Amidon de grâu 2 40 43 Zaharoză 3 5 5 Grăsime din sâmburi de palmier 4 18 Ulei de in 5 1 Ulei de șofrănel 6 1 Ulei de porumb 7 17 Celuloză 8 11 7 Amestec de minerale 9 5 5 Amestec de vitamine 10 2 2 Apă, ml 30 30 Conținut de energie [kj/g] 19,9 21,3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Instalație de lapte permanentă Peiting GmbH, Landshut (86% proteină brută) Kröner GmbH, Ibbenbüren/Westfahlen Nordzucker GmbH, Uelzen OTHÜNA, Ostthüringer Nahrungsmittelwerk Gera GmbH, Gera LARU Langensiep & Ruckebier GmbH, Bottrop Kunella Feinkost GmbH, Cottbus Mazola Unileverettne Deutschland GmbH, GmbH, Rosenberg Mineral-Trace Element Premix C1000 la 100 g: aproximativ 930 mg; P, 730 mg; Mg, 80 mg; Na, 440 mg; K, 710 mg; S, 170 mg; CI, 360 mg; Fe, 20 mg; Mn, 10 mg; Zn, 3 mg; Cu, 800 mg; J, 40 mg; F, 400 mg; Se, 20 mg; Co, 10 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) Vitamina premix C1000 la 100 g: A, 0,45 mg; Colecalciferol, 1,13 mg; K 3, 1 mg; Tiamina, 2 mg; Riboflavină, 2 mg; B-6, 1,5 mg; B-12, 3 mg; Niacină, 5 mg; Acid pantotenic, 5 mg, acid folic, 1 mg; Biotină, 20 mg; Clorură de colină, 100 mg; acid p-aminobenzoic, 10 mg; Inozitol, 10 mg; E, 16,4 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) 26

Material și metode 2.2.3 Proiectarea testelor Pentru a investiga efectele EGCG, au fost efectuate mai multe teste pe animale cu diferite modele de studiu. 2.2.3.1 Experimentul 1: Investigații asupra influenței pe termen scurt și mediu a EGCG asupra parametrilor metabolismului energetic În acest experiment, ar trebui investigate efectele pe termen scurt și mediu ale aplicării EGCG asupra parametrilor metabolismului energetic, în special metabolismul energetic. În acest scop, au fost efectuate două teste parțiale (Fig. 2-2). Fig. 2-2: Evoluția în timp a studiilor pe animale efectuate pentru a investiga efectul EGCG asupra parametrilor metabolismului energetic la șoareci după aplicarea pe termen scurt (1A) și pe termen mediu (1B) RMN Determinarea compoziției corpului utilizând spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (RMN) 2.2.5) Calorimetria indirectă a animalelor ITK; Determinarea parametrilor cifrei de afaceri a energiei (vezi 2.2.6) Oxidarea substratului SO prin intermediul izotopilor stabili (vezi 2.2.7.1) StK t metabolizare cușcă 27

Material și metode Fig. 2-4: acumularea de 13 C în organe și țesuturi selectate, precum și aerul expirat la șoareci după trecerea de la o dietă standard (SD) la o dietă bogată în grăsimi de 13 C (HFD); DOB = Delta peste testul EGCG inițial Testul preliminar a condus la o perioadă de hrănire de o săptămână pentru a determina încorporarea 13 C în funcție de aplicația EGCG. Și aici, șoarecii au fost trecuți de la SD la HFD semisintetic, care conținea ulei de porumb ca singură sursă de grăsime (Fig. 2-5). Bazele sunt descrise la punctul 2.2.7.2. EGCG a fost administrat împreună cu hrana (grupuri: grupul inițial (SD), martor, 0,25%, 0,50% EGCG (HFD), n = 8). Fig. 2-5: Proiectarea testului pentru investigarea încorporării 13 C a trigliceridelor marcate dietetic la șoareci Determinarea RMN a compoziției corpului prin spectroscopie RMN (vezi 2.2.5) O probă de gaze respiratorii pentru determinarea îmbogățirii 13 C prin IRMS (vezi 2.2.7.1) omoară 30

Set 30 l/h. Pentru a menține o temperatură ambiantă constantă (22 C), cuștile de respirație au fost adăpostite în dulapuri climatice (Vötsch Industrietechnik, Reiskirchen-Lindenstruth). Proporția consumului de O 2 (VO 2) și a producției de CO 2 (VCO 2) au fost determinate pentru fiecare animal într-un interval de 6 minute. Conform ecuației. 2-2 (Frenz, 1999). Șoarecii au primit hrana la ora 16:00 pentru a examina influența EGCG atât în condiții post-absorbante, cât și post-prandiale. În studiul pe termen scurt, hrănirea a fost combinată cu aplicația orală EGCG. 36

Materiale și metode Placa este pipetată, se adaugă 150 µl de reactiv enzimatic (RGT), se amestecă și se centrifugează. După un timp de incubație de 10 minute la temperatura camerei, dispariția probelor și a standardului a fost măsurată în raport cu martorul de reactiv (apă) la 500 nm (Power Wave 340, BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall). Concentrația de colesterol din probele de plasmă a fost calculată utilizând ecuația de regresie liniară a seriei standard (ecuația 2-19). ymxn (ec. 2-19) yxmn panta concentrației de dispariție a intersecției liniei drepte cu axa y 2.5.1.2 Acizi grași liberi Principiu Determinarea cantitativă a acizilor grași liberi din plasmă a fost efectuată cu testul NEFA-C (Wako Chemicals GmbH, Neuss) . Principiul reacției este prezentat în următoarele ecuații (ecuația 2-20 până la ecuația 2-22). R COOH Acil CoA sintetaza ATP CoA SH Acil CoA AMP PP i (Ec. 2-20) Acil CoA O Acil CoA oxidază 2 2,3 trans Endol CoA H2O2 (Ec. 2-21) Peroxidază 2 H2 O2 4 Zona aminofenei MEHA Quinonă imină 4 H2O (ec. 2-22) R-COOH ATP CoA-SH AMP PP i acizi grași adenozin trifosfat coenzima A adenozin monofosfat acid fosforic 50

Materiale și metode blankE blank (E2 E1) blank 2 (E3 E2) blank (Eq. 2-29) sampleE sample (E2 E1) sample 2 (E3 E2) sample (eq. 2-30) Mai întâi, diferența dintre cele trei Măsurătorile de extincție (E1-E3) au fost determinate pentru eșantion și valorile martor (ecuația 2-29 până la ecuația 2-30). Apoi se calculează diferența dintre eșantion și valoarea necompletată (ec. 2-31). SampleE ΔE eșantion valueE valoare necompletată (ecuația 2-31) Concentrația a fost apoi calculată utilizând grosimea stratului conform următoarei ecuații (ecuația 2-32): c β HB V MW β HB ε dv 1000 ΔE g/l (ecuația 2 -32) V volum final (ml) MW greutate moleculară -HB (104,1 g/mol) coeficient de stingere a formazanului la 492 nm (19,9 l mol -1 cm -1) d grosime strat (1 cm) v volum eșantion (ml) În cele din urmă s-au calculat concentrațiile calculate ale triplicatelor și s-a luat în considerare diluarea 1: 2 a probelor de plasmă. 2.5.2 Determinarea trigliceridelor din ficat Pentru a determina conținutul de trigliceride din ficat, trigliceridele au fost extrase mai întâi cu tampon HB. Trigliceridele extrase ar putea fi apoi determinate cu setul de determinare a trigliceridelor (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen). 55

Material și metode tampon TE Tris-HCl EDTA autoclavat adică 2 O reglați pH 8,0, autoclavă 10 mm 1 mm 10xMOPS MOPS acetat de sodiu EDTA pH 5,5 7,0; autoclavă (schimbarea culorii în galben) 200 mm 50 mm 10 mm 1xMOPS - tampon de electroforeză 10xMOPS ad 1 l cu dh autoclavat 2 O 100 ml tampon de denaturare 10xMOPS 100 µl 37% formaldehidă 175 µl 50% formamidă 500 µl și 1 ml cu dh autoclavat 2 O care rulează glicerol tampon 500 µl dh 2 O autoclavat 400 µl 10xMOPS 100 µl vârf de spatula bromofenol albastru etidiu bromură diluare 0,1% bromură de etidiu 50 µl autoclavat dh 2 O 950 µl 2.6.4 Purificarea ARN utilizând digestia DNazei Pentru a minimiza posibila contaminare a ARN cu ADN genomic, Extractele de ARN purificate cu kitul TURBO fără ADN (Ambion/Applied Biosystems, Darmstadt). Pentru aceasta, s-au amestecat aproximativ 10 pl ARN (între 5-40 pl ARN) cu 7 pl apă tratată cu DEPC, 2 pl tampon Turbo DNază și 1 pl DNază timp de 30 minute la 37 C într-un ciclotermic (Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research Inc., Waltham, MA, SUA). Apoi s-au adăugat 2 pl reactiv de inactivare a DNazei la 65

Material și metode Tab. 2-12: cantitatea de cdna din seria de diluare pentru determinarea concentrației eficienței primerului 1 0,05 concentrație 2 0,20 concentrație 3 1 concentrație 4 5 concentrație 5 20 concentrație 6 50 cantitate de cdna [ng] Reprezentarea grafică a Concentrațiile logaritmice inițiale ale seriei de diluare (axa x) față de valorile CT (axa y) au dus la o linie de regresie, a cărei creștere a fost utilizată pentru a calcula eficiența (ecuația 2-40, Vaerman și colab., 2004). Eficiența a fost de obicei 85-100%. E 10 1/m 1 (ecuația 2-40) Cuantificarea relativă a expresiei genei a avut loc după normalizarea la o genă de referință (aici: 18SrRNA, ecuația 2-41). ΔC T C T ('gena țintă) C T (18SrRNA) (ecuația 2-41) Valoarea CT calculată a fost apoi scăzută din valoarea fictivă 36 (ecuația 2-42). Se presupune că, cu o valoare CT de 36, nu are loc nici o amplificare a ARNr 18 deoarece condițiile de reacție (de exemplu, concentrațiile de grund, concentrația de MgCl2) nu mai sunt optime la sfârșitul PCR. ΔΔC 36 T ΔC T (ecuația 2-42) Valorile exponențiale ale C T au fost convertite într-o formă liniară prin creșterea la puterea bazei 2 (ecuația 2-43). Expresia genetică relativă 2 C T (ecuația 2-43) 72