Exon terapeutic sărind pentru disferlinopatii jurnalul european de genetică umană

  • Subiecte
  • Abstract
  • introducere
  • Metodele
  • Bază de date
  • AON
  • Cultura celulară și transfecție
  • Analiza ARN
  • rezultate si discutii
  • Exon sărind pentru dysferlin
  • Dați prioritate exonilor DYSF
  • Fezabilitatea exonerării DYSF
  • Observații finale

Subiecte

  • Splicing alternativ
  • Elemente antisens
  • Boala neuromusculară
  • O rectificare la acest articol a fost publicată pe 19 august 2010

Abstract

introducere

Distrofia musculară a brâului de tip 2B (LGMD2B), miopatia Myoshi (MM) și miopatia distală cu debut tibial anterior (DMAT) sunt boli ale mușchiului alelic autosomal recesiv cauzate de mutații ale genei DYSF care codifică disferlina, ducând la absența severă sau completă a proteina disferlină. 1, 2, 3 Majoritatea pacienților prezintă mutații mici: mutațiile stop sau frame shift conduc la proteine ​​trunchiate prematur, în timp ce mutațiile sensibile afectează în general stabilitatea proteinelor. 4 Mai mult de 100 de mutații diferite au fost raportate în baza de date Leiden Open Variation la aproape 200 de pacienți (www.dmd.nl). Deoarece în prezent nu există tratament pentru „disferlinopatii”, absența disferinei are ca rezultat o pierdere treptată a țesutului și a funcției mușchilor membrelor și brâului. 5

exon

Proteina disferlină este exprimată în multe țesuturi, dar în primul rând în inimă și mușchii scheletici. În acest din urmă caz, proteina este localizată la nivelul membranei plasmatice și în veziculele citoplasmatice. Se consideră că disferlina joacă un rol în traficul vezicular și în repararea fuziunii patch-urilor de membrană în celulele musculare. 5 Pierderea disferinei compromite repararea membranei musculare scheletice și duce la pierderea progresivă a fibrelor musculare. 6 Proteina are domenii diferite (Figura 1). Baza de date ENSEMBL prezice șase sau șapte domenii de legare a lipidelor C2 dependente de calciu, un domeniu transmembranar și mai multe domenii „fier” și „disfuncție”. Domeniile C2 mediază probabil fuziunea veziculelor dependentă de calciu cu membrana plasmatică, în timp ce domeniile transmembranare ancorează proteina de membrana plasmatică. 5 Domeniile de fier și disfuncții au încă o funcție necunoscută. 4

Domenii disferlin versus exoni DYSF. Dysferlin conține șase sau șapte domenii de legare a lipidelor C2 dependente de calciu (C2), un domeniu transmembranar (T), un domeniu ferl (L), domeniile FerA și FerB (respectiv A și B) și domeniile Dysf_N și Dysf_C (N și C, respectiv). Domeniile C2 și transmembranare au o funcție în repararea membranei. Funcția celorlalte domenii este încă necunoscută.

Imagine la dimensiune completă

Astfel, este posibil ca ocolirea mutațiilor disferlinului să ducă la proteine ​​disferlinice mai mult (parțial) funcționale și, prin urmare, să aibă potențial terapeutic. O modalitate de a realiza acest lucru este de a modula îmbinarea pre-ARN-urilor cu disferlină folosind oligonucleotide antisens (AON) sau secvențe antisens, care maschează exonii țintă ai aparatului de îmbinare, astfel încât să nu fie incluși în ARNm final („exon jumping” ) (Figura 2). Dovada inițială a conceptului a fost recent arătată în celulele de control și derivate de pacienți, unde sărirea exonului 32 a fost indusă de AON sau de un snRNP U7 modificat în care secvența antisens originală a fost înlocuită de secvența țintă antisens. 9

Treceți peste un exon indus de antisens. Panoul din stânga: în acest exemplu, o mutație la exonul 32 are ca rezultat un codon de oprire prematur (indicat de schimbarea de la negru la alb în pre-mARN (sus) și mARN (în mijloc), ceea ce duce la o proteină trunchiată prematur (jos) Panoul din dreapta: Când se utilizează oligonucleotidele antisens (AON) care vizează exonul 32, acestea se hibridizează cu exonul respectiv, mascându-l astfel din mecanismul de îmbinare, care determină să sară acest exon. Ca exon 32 în cadru (lungimea sa este divizibilă cu trei), săritura nu va perturba cadrul de citire (ARNm va deveni negru în panoul din mijloc) și poate fi generată o proteină completă, care lipsește puțin în mijloc (jos).

Imagine la dimensiune completă

De fapt, abordarea de săritură a exonului este în prezent cea mai promițătoare abordare terapeutică pentru distrofia musculară Duchenne (DMD). Această boală este cauzată de pierderea completă a distrofinei funcționale din cauza mutațiilor care perturbă cadrul deschis de citire a genei DMD. La fel ca disferlina, distrofina conține atât domenii esențiale, cât și domenii mai puțin esențiale, subliniat de faptul că pacienții cu mutații din domeniul redundant central au o afecțiune mai puțin severă numită distrofie musculară a lui Becker. 12, 13, 14 Exonul medicamentos sărind AON la pacienții cu DMD își propune să restabilească cadrul de citire deschis, să permită producerea unei proteine ​​parțial funcționale și conversia DMD severă într-un fenotip BMD mai ușor. Această abordare a fost dezvoltată în laboratorul nostru și de colegii din Japonia, Australia și Marea Britanie 10, 15, 16, 17, 18 și se află în prezent în studii clinice de fază I/II. 19, 20

În acest studiu, vom analiza care sunt exonii DYSF care ar putea fi ținte adecvate pentru saltarea exonului mediată de antisens și care sunt mai puțin sau inadecvate, în funcție de domeniile de codificare a proteinelor și de mutațiile raportate. Arătăm, de asemenea, că utilizarea recomandărilor noastre stabilite după analiza retrospectivă a setului nostru de AON DMD permite identificarea cu ușurință a AON-urilor care induc omiterea exonului DYSF .

Metodele

Bază de date

Mutațiile raportate la 8 mai 2009 în baza de date DYSF LOVD (www.dmd.nl) au fost analizate.

Proiectarea AON s-a bazat pe recomandările noastre pentru exonii DMD și a vizat să vizeze structuri de ARN secundar parțial deschise (prezis de m-fold 21), prezența RESCUE-ESE și SC35 prezisă și absența site-urilor Tra2 β prevăzute (folosind splicing uman). căutător 22) și energie de legătură favorabilă. 21, 23 Toate AON-urile (Tabelul 1) vizează secvențe de exoni interni și constau din ARN 2'-O-metil cu o coloană vertebrală de fosforotioat pe toată lungimea și au fost fabricate de Eurogentec (Seraing, Belgia).